原位交联菌丝结合脂肪酶非水相催化特性的研讨.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 原位交联菌丝结合脂肪酶非水相催化特性的研究 滕云王栋，徐岩 (江南大学生物工程学院酿酒微生物学与应用酶学实验室，无锡，江苏214036) 摘要：本文对华根霉产全细胞脂肪酶采用戊二醛进行原位交联固定化，研究了交联固定 化后的金细胞脂肪酶在非水相体系中的催化特性．当戊二醛浓庹为1％(w／w)，处理时问 30rain时，固定化后的全细胞酶乙醇耐受能力明显增强，相对于未处理的全细胞酶提高了近 3倍。用于高浓度底物己酸乙酯合成，固定化酶的转化能力明显强于未处理的酶，当底物浓 度为1．5M时，120h后固定化酶催化的反应转化事可达80％，固定化酶的温度稳定性也有所 增加．操作稳定性实验表明，固定化全细胞酶有更长的半衰期，达到2051h，与夫处理的全细 胞酶相比提高了近5．5倍。 前言 脂肪酶(EC3．1．1．3)作为一种甘油酯水解酶，随着非水相酶学的不断深入和发展，其 在非水相中的催化能力也越来越为各研究者所关注，并且已成功用于各种酯类合成及手 性拆分[1’2]。细胞结合的脂肪酶即全细胞脂肪酶本身就可以可看作是一种天然固定化的 催化剂[3]，与游离酶相比其制备无需复杂的提取纯化过程，活力损失小，有更好的稳定 性，已广泛用于各种酯的合成，包括芳香酯[4]、生物柴油[5]等。尽管如此，全细胞酶也存 在重复使用批次有限，对溶剂和短链醇和酸的耐受性不强等缺点，正是这些缺点束缚了 其工业化应用。 细胞固定化技术是在酶的固定化技术基础上发展而来，且实际运用速度超过固定化 酶，它在体现了全细胞酶优点的基础上进一步体现了固定化技术的优点。霉菌固定化方 法大致有三种：吸附，包埋和原位交联。原位交联，即是不改变酶所存在的位置，而采用 交联剂对微生物细胞进行处理，使得菌丝体相互作用而连接起来形成一定的结构，同时 交联剂进入细胞后作用与胞内酶蛋白，使得酶分子和细胞发生交联作用从而形成固定化 酶。较早提出原位交联的是KamariahLong等人[6]，他们采用甲基乙二醛和戊二醛对黄 曲霉胞内脂肪酶进行处理，甲基乙二醛处理得到的菌体酶活提高了48％，50℃时的稳定 性也提高了58％．BanK．等人c73将Rhizopus oryzae细胞采用吸附法固定在聚氨酯泡 沫上，采用甲醇三步流加法生产生物柴油，转化率可达90％以上，并且将吸附固定化后的 细胞再采用戊二醛进行交联，所得到催化剂稳定性更好，并且能有效防止胞内酶的流失。 华根霉CCTCCM201021为本实验室从大曲中筛选得到的一株胞内脂肪酶高产菌 株，非水环境中能有效催化短链芳香酯的合成n]．本研究采用戊二醛对华根霉所产菌丝 结合脂肪酶进行原位交联，探讨了交联固定化酶在非水相中的催化稳定性，及对底物短 链醇的耐受性。 滕云等：原位交联菌丝结合脂肪酶非水相催化特性的研究 561 1 材料与方法 1．1 菌种 chinensisCCTCC Rhizopus M201021，实验室保藏菌种。 1．2培养基 1．2．1斜面种子培养基：马铃薯一葡萄糖琼脂培养基 1．2．2 0A，橄榄油 摇瓶培养基：麦芽糖10A，蛋白栋4％，MgS040．05％，K2HPOl0．2 2％，豆饼粉4 0A，pH5．5。 1．3实验方法 、 1．3．1菌体培养及冻干脂肪酶的获得 24h得到冻干脂肪酶。 1．3．2菌体交联处理[63 收集培养72h的菌体，去离子水洗涤两次，过滤收集菌丝体。称取一定量的湿菌体 搅拌，转速为150rmp，待菌体完全分散后加入一定体积的25％的戊二醛直到所需的浓 度，处理一定时间后抽滤，并用大量水洗涤。洗涤两次后抽滤除去水分，加入一定体积磷 酸缓溶液后冷冻干燥。 1．3．3脂肪酶合成酶活测定 合成酶活采用改进的Persson等人‘83报道的方法。辛