原位杂交检测基因枪轰击和肌肉注射PRRSVORF5基因疫苗在BALBc小鼠体内动态分布规律研讨.pdf

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 原位杂交检测基因枪轰击和肌肉注射PRRSV ORF5基因疫苗在BALB／c小鼠体内动态分布规律研究 豆文波1，2，程安春l，2·，汪铭书l，2，希尼尼根l，3，陈希文1，2，刘菲1，陈孝跃l，2 (1．四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014；2．动物疾病与人类健康9)1J省重点实验室，四J 雅安625014；3．内蒙古农业大学动物科学与动物医学学院，内蒙古呼和浩特010018) 轰击和200pg、lOOpg+100pg 同时间取免疫部位肌肉、肠、肝、脾、肾、心肌、肺脏和脑等组织器官，多聚甲醛固定，石蜡包埋。用根 据ORF5基囚序列设计的特异性生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，检测基冈枪轰击和肌肉注射 免疫后不同时间PRRSV 检测结果如下：免疫后3h就在基因枪轰击组和肌肉注射各组BALB／c小鼠的免疫部位肌肉、肠、肝、脾、 肾、心肌、肺脏和脑中均检测到强阳性杂交信号；佐剂组各组织检测到的阳性杂交信号在强度和存留时间 上都强与同剂量肌肉注射组；基因枪组轰击组虽然导入疫苗剂量较少，但是仍然在仍然在小鼠各组织中保 留很长时间；肌肉注射组肌肉注射基因疫苗剂量越大，基因疫苗在组织中保留时间越艮。以上结果表明： 基因枪轰击和肌肉注射都是PRRSVORF5基因疫苗良好的免疫途径；佐剂对疫苗的存留有正协同作用；肌 肉注射各组基因疫苗保留时间与剂量呈正相关关系。 关键词：原位杂交； BALB／c小鼠；基因枪轰击； 肌肉注射；PRRSV基因疫苗；分布；， 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)是披膜病毒科动脉炎病毒属的成员，其所引起的疾病猪呼吸 与繁殖障碍综合征是二十世纪束发现的猪的一种新的高度传染性疾病，1987年首先发现于美国的北卡罗那 洲，九十年代以来，几乎传遍世界上所有养猪的国家，造成世界养猪业的严重损失。郭宝清等于1996年 在北京地区分离到了PRRSV，首次证实了PRRS在我国的存在，现已有多个省市报道有本病的发生，其 中以北京和天津地区尤为严重，而且近年来还呈流行趋势。该病的防制以预防为主，但传统的疫苗在应用 中均存在一定的缺陷，随着基因疫苗的出现和发展，基因疫苗作为一种新的疫苗有希望被应用到实际生产 中。 但是基因疫苗注入机体后能存留多长时间，能否自我复制，在体内如何代谢降解，组织分布情况等都 是人们普遍关心的问题，也是制约其能否投入临床应用的关键。本文将PRRSVORF5基因疫苗 组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对定量分析的～种研究方法。该技术由于具有特异性强、敏感 性高和定位精确等优点，现在已广泛地应用于生物学和医学等各个领域的研究之中。本研究成功地检测到 保存于石蜡包埋的组织切片中PRRSVORF5基因疫苗的阳性杂交信号。从而为阐明PRRS基因疫苗的免疫机 理和临床应用提供理论依据。 ． 1材料与方法 验课题组研制。 碱性磷酸酶结合物)和NBT／BCIP(5．溴．4．氯3。吲哚．磷酸／氮蓝四唑)等购自成都天泰公司。 1．3实验动物分组及材料固定140只雌性BALB／e小鼠随机分为7组：(1)6lag 245 猪传染病 基因枪轰击组20只；(2)200pg 00pgpcDNA-IL-2肌肉注射组20只；(4)lOOHg pcDNA．PRRSVoSC2．ORF5+1 肉注射组20只：(5)50pgpcDNA．PRRSV-SC2一ORF5肌肉注射组20只：(6)100p．gpcDNA3．1(+)质粒 各取两只BALB／e小鼠的胃、肠、肝脏、脾脏、肾脏、心肌、肺脏、脑和免疫部位肌肉。4％多聚甲醛甲醛 固定，常规石蜡包埋。 1．4原位杂交 ， GTCTGTGCCCTGGCTGCG11’GACTTGCTTC GT。3’，5’端用生物素(Biotin)标记，探针的合成与标 记均由上海生物J=程公司完成。 1．4．2玻片处理载玻片和盖玻片在酸中浸泡数小时，乙醇浸泡过夜，流水冲洗，然后蒸馏水冲洗2次，擦 馏水冲洗，干燥备用