两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析研究.pdf

疾病控制 两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2 基因的克隆与序列分析 张福良1·2孙丽华1·3宋长绪1¨杨呜琦2郝永清3刘燕玲1武占银4 (1．广东省农科院兽医研究所．广东广州510640；2．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100； 3．内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特0100183；4．宁夏动物防疫站。宁夏银JII750000) PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCVlORF2全 基因(702bp)o将此基因片段克隆人pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD．PCVl．ORF2并对其测序， 表的PCVlORP2基因的同源性介于97．3％-99．9％，与PCV2ORF2基因同源性介于67．9％．68．4％，二者 编码的蛋白在几个功能区比较保守；抗原表位预测表明PCVl-ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。 关键词猪圆环病毒l型ORF2基因克隆序列分析 猪圆环病毒(Porcine 的动物病毒。该病毒为一种小的无囊膜的单链环状DNA病毒，呈20面体对称，直径17—20nm，以 滚环方式进行复制(Tischer等，1982)o 为PCVI无致病性，包括PCV-PKl5及其它流行于猪群但无致病性的分离株，实验证明其广泛存在 于猪原代细胞系及猪群中；PCV2具有致病性，与近年来世界各国广泛流行的断奶仔猪多系统衰竭 综合征(Post WeaningMultisystemicWasting 和多系统病理损伤为特征，已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。 白进行了分析，旨在为PCV2的流行病学、致病机理及其在PCV2感染中的作用等相关领域的研究 提供依据o 1材料与方法 1．1病毒、质粒和菌种 18-T载体购自TaKaRa公司(大连)，宿主菌DH5a为本实验室保存。 1．2试剂 Biolabs 量提取试剂盒、pMDl8-T载体等购自TaKaRa公司(大连)；XhoI、Kp．I为NewEngland 基金项目： 作者简介：张福良(1974一)，男。讲师，硕士研究生，研究方向：动物病理学，现工作单位：岳阳工学院牧医工程 系。 ¨通讯作者：宋长绪，E-mail：一cxsonq2004@163,com，—cxsonq@Y—ahoo,conl。 351 中国畜牧兽医学会养猪学分会论文集 产品。 1．3引物设计 TA(叮CGAGp汀GAC I酶切 I酶切位点，引物P2中加有Kpn 便基因的克隆及真核表达载体的构建，在引物Pl中加有Xho 位点，扩增片断为ORF2全基因(702 bp)o引物由上海英竣生物技术有限公司合成。 1．4 PCR模板的制备及PCR扩增 提DNA作为模板进行PCR扩增。PCR总体积为25止，其中Premix12．5儿，上下游引物各O．5止， rain，然后以94℃1rain、58℃1rain、 模板1此，余下用灭菌DEPC水补足。反应条件为94。C预变性5 72。Cl min进行30个循环，最后72。C延伸10 rain。反应结束，分别取5¨LrCR产物用l％琼脂糖凝 胶电泳鉴定产物。 1．5 PCR产物的克隆及酶切鉴定 PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶，用试剂盒回收DNA并按常规方法 落进行培养，提取质粒用Xho I进行双酶切鉴定。 I和gpn 1．6 ORF2基因序列及其编码聋白的一级结构分析 将酶切鉴定为阳性的质粒所对应的菌液用通用引物进行测序，测序由上海英竣生物技术有限公 核苷酸及其编码的氨基酸