两株禽源冠状病毒分离、鉴定及基因组序列分析研究.pdf

摘要 本研究对广东省广州、深圳、云浮、汕头等地送检的1000多 份家禽及多种禽类野生动物的脏器组织及喉头拭子样品进行常规 处理后，接种SPF鸡胚，盲传3代进行病毒分离。通过对接种鸡 胚病变观察以及对收获的鸡胚尿囊液进行RTPCR检测，共分离到 四株冠状病毒，其中孔雀样品分离到1株病毒，鹤鸽样品分离到1 株病毒，黄羽肉鸡样品分离到2株病毒。 分离到的四株冠状病毒的RTPCR检测结果为:冠状病毒通用 引物和IBV3UTR引物检测结果为阳性;SARS-CoV聚合酶lb高 保守区特异性引物检测结果为阴性。 为了更加深入了解野生动物的冠状病毒分离株与鸡传染性支 气管炎病毒的亲源关系，本实验系统性的研究了孔雀分离株和鹤 鸽分离株的生物学特性，并对两株病毒进行了全基因组序列分析。 在对生物学特性的研究中发现:两毒株对鸡胚有强致矮小化 作用;未处理的病毒尿囊液不具血凝性，而胰酶处理后病毒株均 具有较高滴度的血凝性;对NDV-11疫苗毒存在明显的干扰效应。 生物学试验表明两毒株都具有传染性支气管炎病毒典型的生物学 特性。 全基因组序列分析:孔雀分离株包括poly(A)尾在内全长 27434bp,鹤鸽分离株包括poly(A)尾在内全长27503bp。利用 ZCURVE软件分析其基因组结构时发现:孔雀分离株lab基因氨 基酸编码6610aa,S基因编码3932aa,3a基因编码57aa,3b基因 编码64aa,E基因编码108aa,M基因编码225aa,5a基因编码65aa, 5b基因编码82aa,N基因编码409aa;鹤鸽分离株lab基因氨基酸 编码6639aa,S基因编码3969aa,3a基因编码57aa,3b基因编码 62aa,E基因编码108aa,M基因编码225aa,5a基因编码65aa, 5b基因编码82aa,N基因编码409aa。两病毒分离株的基因组都 具有典型的POL-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N结构。 将两毒株的结构基因分别和GeneBank资源库中报道序列进行 同源性比较发现:孔雀分离株的主要结构结构基因都和Mass型的 M41有高度的同源性，而鹤鸽分离株的主要结构基因与其他 IBV 毒株的同源性却较低，两病毒分离株间的同源性也较低。 从本研究结果看，孔雀分离株应为IBVM41的变异株，而鹤 鸽分离株则可能是中国地方毒株和其他IBV毒株同源重组的病毒。 关键词:禽 冠状病毒 生物学特性 基因组克隆 序列分析 本论文常用缩写词 Amp Amplicillin 氨节青霉素 ArV Avianinfluenzavirus 禽流感病毒 Bp Basepair 碱基对 cDNA ComplementaryDNA (RNA)互补DNA DEPC Diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酷 DMSO Diethylsulfoxide 二甲基亚矾 DNA Deoxyribonucleotideacid 脱氧核糖核酸 E.B Ethidiumbromide 澳化乙锭 EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid 乙二胺四乙酸 H Hour 小时 HA试验 Hemagglutinintest 血凝试验 HI试验 Hemagglutinininhibitiontest 血凝抑制试验 LB Lauriabroth LB肉汤 习1，.n minute 分钟 PCR