电化学免疫分析方法测定饲料中的已烯雌酚研究.pdf

持久性有机污染物论坛2006暨笫一届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集 电化学免疫分析方法测定饲料中的己烯雌酚 王术皓1∥，庄惠生1，王传涛2，杜凌云2 (1东华大学环境科学与工程学院，上海，200051；2聊城大学化学化工学院，聊城，252059； 毒联系人，E-mail：shtthaowang@sohu。corn) 摘要：本文将以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为探针，邻苯二胺作为辣根过氧化物酶 的底物，自制抗己烯雌酚抗体为免疫反应试剂，建立了一种测定己烯雌酚的电化学酶免疫分析新方 法，方法测定己烯雌酚的线性范围为1．0—500ng．mL～，检出限为0．4ng．mL～。并应用于动物饲料及 血清中己烯雌酚的测定，结果满意。 关键词：己烯雌酚；辣根过氧化物酶；邻苯二胺；酶联免疫分析；伏安法 1引言 中强残留并对生物体具有明显的破坏作用之前的几十年里，它曾被广泛地应用于临床治疗和畜牧业 生产上。欧盟、美国、中国等国家从20世纪70年代末开始关注和重视己烯雌酚的残留及危害问题， 并先后颁布禁令，将己烯雌酚列为禁止在食品动物中使用的兽药。然而，由于强大经济利益的驱使， 滥用己烯雌酚的现象依然存在。因此，建立灵敏、准确、简便的测定己烯雌酚的分析方法具有十分 重要的意义。 国内外报道用于检测DES的理化方法主要有高效液相色谱法(耻LC)[1_5】、气相色谱法(Gc)【∞】 等。免疫检测的方法主要有放射免疫法(RJA)tml2】、酶联免疫法(EIA)t13】等。由于色谱分析方法耗时、 花费高以及需要昂贵的仪器，不便推广应用；现在人们更重视特异性强、灵敏度高、方便快捷、低 成本的免疫检测方法。 本文利用自己制备的抗己烯雌酚抗体，建立了测定己烯雌酚的电化学酶免疫分析方法，并应用 于实际样品的测定。 2实验部分 2．1主要仪器 参比电极，铂丝电极为辅助电极构成三电极系统；PHS一3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)；冷冻干 燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；WDP型微生物多用培养箱 (嵫用黼)；透析袋 购自北京鼎国生物技术有限公司)。 2．2主要试剂 己烯雌酚(Sigma公司)；N_羟基琥珀酰胺(中国医药集团上海化学试剂公司)：二环己基碳二亚 胺(Sigma公司)；二甲亚砜(天津市福晨化学试剂厂)；牛血清蛋白(上海实生细胞生物技术有限公司)； 卵清白蛋白(北京拜尔迪生物公司)；己烯雌酚单羧甲基醚(自制)；抗己烯雌酚抗体(自制)；邻苯 二胺：(Sigma公司)。 OPD mmol／L 1．0mL+1．0 4．0mL+0．1moUL 邻苯二胺底物溶液：1．O×10呓mol／L H202 pH4．8 347 持久性有机污染物论坛2006暨第一届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集 OPD：准确称取O．1081 mL，现用现配。(1)1．0x10七mol／L HAC-NaAC1．0mL，二次蒸馏水稀释到10 4．8 HAC HAC．NaAC：分别配制0．1mol／L mL，新鲜配制，现用现配；(3)O．Imol／L 蒸馏水定容至100 pH 和0．1mol／LNaAC溶液，适量混合，调节pH为4．8。 所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2．3缓冲溶液 mol／L 包被缓冲溶液：0．10