药学分子生物学实验.pptVIP

- + 琼脂糖凝胶电泳 样品 加上样缓冲液(示踪指示剂) ，加SYBR green I （荧光染料），混匀； 上样缓冲液包含二甲苯青（相应于2KbpDNA）和溴酚蓝（相应于20bpDNA）两种染料 荧光染色原理 核酸的荧光染料如溴化乙锭（EB)、SYBR Green I等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出荧光。 荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比（SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性；EB则与单链、双链甚至三链DNA均可高效结合）。 SYBR Green I 工作原理 SYBR GreenI 能结合到双链DNA的小沟部位 紫外灯下发出荧光 SYBR Green 紫外投射分析仪 实验3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定 质粒DNA及酶切产物 琼脂糖凝胶电泳操作步骤 样品： 质粒DNA 10μl;酶切产物 10μl； 分别加上样缓冲液2μl，加SYGR green I 2μl，混匀； 取10μl加入加样孔中； 110V稳压，电泳至凝胶2/3处； 紫外灯下观察结果（与DNA Marker比较）； 记录并画出示意图。 重组质粒DNA 目的基因 GAPDH（205bp） 质粒载体2692bp 重组质粒载体2897bp A＋ Pvu II: CAGCTG GTCGAC 535bp 2362bp 限制酶切产物分析 1 2 B 限制性内切酶反应影响因素： DNA的纯度和结构 反应缓冲液的pH值及离子浓度 酶解温度和时间 限制酶质量 思考题 溶液I，II，III的作用？ 苯酚，氯仿，异戊醇的作用？ 无水乙醇，70％乙醇的作用？ TE溶液（pH8.0）,RNase A的作用？ 思考题： 琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的基本原理？ 影响DNA电泳迁移率的因素有哪些？ 上样缓冲液的成分和作用？ * * PCR Thermocycler 限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例： E Escherichia （属） Co coli （种） R RY13（品系） I 首先发现 在此类细菌中发现的顺序 * * 苯丙氨酸是人体生长和代谢所必需的氨基酸，食入体内的苯丙氨酸一部分用于蛋白质的合成，一部分通过苯丙氨酸羟化酶作用转变为酪氨酸，发挥功能。 未经治疗的患儿3～4个月后逐渐表现出智力、运动发育落后，头发由黑变黄，皮肤白，全身和尿液有特殊鼠臭味，常有湿疹 。 * 图中用方框表示男性,用圆表示女性,阴影表示可能是患者 * 简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸内切酶，为原核生物所特有。 Ⅱ型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, RE） 限制性核酸内切酶 作用模式: 在特定的位点上精确切割双链DNA分子，产生特异末端的DNA片段。 识别序列：双链DNA特异的碱基对(一般4?6个) 在识别序列内特异切割DNA 磷酸二酯键断裂 载体: 能将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。本质为DNA。 基本特征： 能自我复制并具较高的拷贝数。 带有遗传筛选标记（抗药性、酶基因等） 。 有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选 重组质粒DNA 目的基因 GAPDH (205bp) 质粒载体2692bp 重组质粒载体2897bp CAGCTG GTCGAC Pvu II酶切产物：535bp, 2362bp (Pvu II) (Pvu II) Pvu II 限制酶切反应体系（20 μl ） ddH2O 10 μl 10 x 缓冲液（ 10 x b） 2 μl 重组质粒DNA 7 μl Pvu II 1 μl 混匀，37 ℃水浴 1h 加样注意事项： 1. 直接加到液体里面，不要加到管壁上 2. 加完后保持液体在管底，勿使液体溅起 限制性内切酶反应影响因素： DNA的纯度和结构 反应缓冲液的pH值及离子浓度 酶解温度和时间 限制酶质量 ? 根据特异识别序列切割DNA片段 ? 用于基因组计划研究（物理图谱，基因定位，DNA同源性分析 , DNA甲基化碱基的识别与切割） ? 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断 限制性内切酶用途：“分子剪刀” 二、限制性片段长度多态性分析 （RFLP restriction fr