耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1β内酰胺酶耐药基因的探讨.docVIP

精品论文 参考文献 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1β内酰胺酶耐药基因的探讨 1.栖霞市人民医院 山东烟台 265300；2.山东大学附属省立医院 山东济南 250021 摘要：目的 探讨KPC和NDM-1beta;内酰胺酶耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药基因。方法 本次研究对象来源于我院出现的30株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，开展药敏试验、碳青霉烯酶检测、金属beta;-内酰胺酶检测、AmpC酶三维试验、基因检测及DNA测序等试验并检测基因，分析KPC和NDM-1beta;内酰胺酶的耐药基因。结果30株100%耐药于亚胺培南、美罗培南及头孢类药物，Hodge试验阳性率为90.0%，EDTA-2Na纸片协同试验阳性率为26.7%，AmpC酶三维试验阳性率为23.3%，耐药基因检测阳性率为56.7%，均携带KPC-2，无NDM-1基因。结论 携带KPC型碳青霉烯基因为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌主要耐药机制。 关键词：耐碳青霉烯类；肠杆菌科细菌；KPC；NDM-1beta;内酰胺酶；耐药基因 碳青霉烯类抗生素包括美罗培南、亚胺培南等为临床治疗革兰阴性杆菌的常用药物，尤其是治疗持续高产AmpC酶（C类头孢菌素酶）和产ESBLs（超广谱beta;内酰胺酶）等革兰阴性杆菌感染的主要药物，亦被当做最后防线[1]。临床逐渐增加该类抗生素的使用范围与次数，致使临床肠杆菌科细菌敏感性不断降低，甚至陆续出现耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌。耐药菌株主要特点在于易播散且治疗药物有限[2]，在极大程度上影响临床感染治疗效果。为减少临床耐碳青霉素烯类肠杆菌科细菌数量，强化临床治疗效果，本文现选取30株耐药菌株，开展多项试验分析其耐药基因，便于临床更好预防耐药现象，详述如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 本次研究对象来源于我院ICU2015.2～2016.2出现的30株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，其中肺炎克雷伯菌为25株，大肠埃希菌2株，霍氏肠杆菌2株，产气肠杆菌1株，均来自ICU住院患者引流液、痰液、胸水、血液、导管及分泌物标本，应用细菌鉴定药敏仪明确30株菌株菌种。 1.2 一般方法 准备好下列仪器与试剂：M-H干粉、美罗培南与亚胺培南药敏纸片、DNA ladder与PCR试剂、PCR扩增仪与细菌鉴定药敏仪、DNA测序仪?? 1.2.1 药敏试验 采用细菌鉴定药敏仪对抗菌药物敏感性予以检测，结合抗菌药物敏感性试验执行标准判断抗菌药物的敏感性，将耐美罗培南与亚胺培南菌株筛选出来，再对二者耐药性予以验证，主要应用纸片琼脂扩散法。大肠埃希菌为质控菌株。 1.2.2 检测碳青霉烯酶 主要方法为改良Hodge试验，依据抗菌药物敏感性试验执行标准推荐方法开展。将质控菌株菌液配制出来，其单位为0.5麦氏浊度，稀释液用1：10无菌生理盐水，在药敏试验平板上均匀涂好，干燥时间约4min，将美罗培南药敏纸片10mu;g 贴在平板正中，接种环将待测菌3～5个挑出，接种时划线，起点为平板中心纸片边缘，终点为平板边缘，控制长度在23mm左右，培养液温度为35℃，过夜后观察结果。阳性为标准质控菌株交汇于待测株抑菌环处大肠埃希菌增长变强，反之则为阴性。产碳青霉烯酶KPC-2型肺炎克雷伯菌为阳性质控株，本组经测序比对与扩增后明确携带KPC-2基因。 1.2.3 检测金属beta;-内酰胺酶 应用亚胺培南-EDTA纸片协同试验，将EDTA.Na2溶液0.1mol/L配制出来，在空白纸片上取出5mu;l，在无菌状态下自然干燥。配制受试菌为106CFU/ml，在M-H平板上涂上菌悬液，将IPM纸片贴于完成接种的受试菌平板正中，将空白纸片与EDTA.Na2纸片分别在上下两端贴好，将CAZ与CTX纸片分别在IPM纸片左右贴好，任何纸片抑菌环扩大均判定为阳性，反之为阴性。 1.2.4 AmpC酶三维试验 将细菌酶液提取出来，主要应用反复冻融法，挑取待测菌落并在胰蛋白大豆肉汤12ml中接种，孵育箱增菌5h，温度控制在35℃，混匀。行离心处理，时间为25min，速度为4000r/min，反复冻融沉淀物，5次，温度为-70℃。将PBS1.5ml 0.01mol/L加入并混匀，再次离心，取上清液，即得酶提取物。在涂有质控菌株菌液0.5麦氏单位的M-H平板中央将头孢西丁纸片贴上，而后无菌刀片挖槽，3mm宽，15mm长，放射状挖于平板边缘，避免触及底部。添加30mu;l酶液，孵育对结果予以观察。阳性标准为头孢西丁纸片与槽交界处矢状细菌生长区域，反之为阴性。 1.2.5 基因检测 加热煮沸将DNA模板制备出来，对N