大分子技术.ppt

生物大分子的分离、 纯化、鉴定、定量技术; 生化与分子生物学;分子医学;诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学或医学奖中有31项与生化与分子生物学有较密切的关系，而化学奖中则有34项相关；尤其是20世纪五十年代以来，52％的生理或医学奖和40％的化学奖属于生化与分子生物学领域，二者之和相当于另外设立了一个生化与分子生物学诺贝尔奖。 ;生化技术与分子生物学技术; 得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子生物学研究面临的首要问题，也是关键性的第一步 对特定生物分子进行定性\定量分析是最常用的研究策略;（ 一）破碎、裂解细胞;（二）基因组DNA制备 1、破碎、裂解细胞（胍、SDS等） 2、除蛋白、组织碎片：离心、饱和酚或酚氯仿抽提 3、除RNA： RNase（不含DNase或50oC处理） 4、除盐等小分子： 乙醇沉淀，12000rpm以上离 心 5、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶K、酚氯仿抽提、柱层析，密度梯度超离心 ;注意;1.2.完整的真核DNA 3.?DNA 4.?DNA+HindIII 5.完整的真核DNA 6.酶解的DNA 7. ?DNA+HindIII ;（三）总RNA 1、破碎细胞：胍、酚等变性剂，注意缩短取出组织和组织研磨匀浆成为单细胞悬液之间的时间 2、除核蛋白：低盐、离心 3、除少量DNA：不含RNase的 DNase 4、除多糖：12000rpm以上离心 5、除盐等小分子：乙醇沉淀 6、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶K、酚氯仿抽提、柱层析 ;注意： 防RNase;（四）质粒载体;提取质粒原理; 1 2 3 4 5;操作;;（五）特殊要求的核酸分子分离纯化方法;特殊分离;;(六)、总蛋白质的分离纯化方法;二、生物大分子的鉴定和定量（一）紫外分光法鉴定定量原理：;总量的定量 、鉴别方法;（二）特异分子的鉴定定量;分子生物学技术在分子病理、证的实质、 分子 药理研究中的应用;核酸、蛋白质与生理功能的关系; ;（2）激素水平——激素的合成、分泌、与激素受体结合、 调节靶细胞内蛋白活性及基因表达调控;神经、内分泌、免疫网络;基因表达调控的调节物;2、生物药物种鉴定、分类、育种;3、制备昂贵的中药成分或去除有害成分;达尔文终结者;常用分子生物学技术;PCR扩增原理——试管中的半保留复制;RT-PCR;;二、基因克隆技术（重组DNA技术）;逆转录 酶切;;克隆的载体;质粒——染色体外共价闭环双链小分子DNA;三、分子杂交与印迹技术;变性;（二）杂交印渍技术;;1.Dot/slot blot;2.Southern blot ; 1.基因组DNA的结构分析; 2.特异基因的突变分析 ;探针标记技术;3.RNA印渍技术（Northern blot );Northern blot ;（4）蛋白质的印渍分析;DOT/SLOT BLOT 直接点膜杂交与印迹结合 SOUTHERN BLOT DNA电泳与印迹杂交结合 NORTHERN BLOT RNA电泳与印迹杂交结合 WESTERN BLOT 蛋白质电泳与印迹免疫化学结合 ;反向dot blotting ——芯片技术;特异mRNA、蛋白质定量方法的选择;生物大分子分离纯化鉴定定量技术路线的选择;　　　　　需提取纯化： SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT （DOT BLOT） WESTERN BLOT 要防降解， 纯度、完整性要求低于RT-PCR， 过程长、灵敏度低，可靠性高，结果较客观;四 、基因表达的干预;2.核酶技术 是一种特殊的反义RNA，但它除了封闭基因表达外还有催化作用，可与互补的mRNA结合然后把它切割，切割不断反复进行，从而破坏翻译的模板，抑制靶基因表达。 3.RNA i（RNA interference）技术 一般是指利用与靶基因互补的双链RNA片段抑制阻断靶基因表达。 ;RNA i（RNA interference）技术产生;RNAi诱导PTGS的原理;五、基因表达谱技术