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离子强度的选择 离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。 一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间 凝胶浓度的选择 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为： （1）非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0%的琼脂糖凝胶； （1）排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE 凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离； 凝胶浓度 (C=2.6%) 分子量范围 (kDa) 凝胶浓度 (C=5%) 分子量范围 (kDa) 5 30~200 5 60~700 10 15~100 10 22~280 15 10~50 15 10~200 20 2~15 20 5~150 凝胶浓度与分子量测定的关系 PAGE的具体操作过程 制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶； 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）； 电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部； 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）； 照相、凝胶干燥： 定量测定： SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应,蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；SDS仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。 SDS的原理 蛋白质分子的解聚 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变 未知蛋白质分子量的测定 基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定； 以不同分子量的标准蛋白进行SDS电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量； SDS电泳后的样品活性恢复 SDS电泳的操作步骤与常规PAGE电泳基本类似； 但由于SDS电泳后，样品已经变性。所以，去除SDS后，蛋白质的活性恢复十分重要； 一般来说，SDS不一定会导致不可逆变性 但有许多因子会影响活性的恢复（纯度、蛋白酶的影响） 样品活性恢复方法 在凝胶中恢复活性 只有单体蛋白、有相同亚基组成的蛋白才能够使用这种恢复方式；异丙醇、醋酸、水（5/2/13）去除SDS，然后以缓冲清洗； 电泳转移后恢复活性 电泳转移后，再进行一次连续电泳便可去除SDS，而蛋白则留在膜上； 洗脱后，在自由溶液中恢复活性 尿素、透析袋 8.3.2 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。 根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。 Chapter8 电泳技术Electrophoresis 8.1 概念 8.2 电泳的基本原理与分类 3.3 各种电泳技术 电解质在电场作用下发生定向泳动的现象。 荷电的胶体粒子在电场中的移动； 电泳分离：利用电解质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。属速度分离法(无平衡现象)。 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起