第3节植物原生质体培养.pptVIP

* * 第3节植物原生质体培养 1.1什么是原生质体：？ 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。 原生质体：植物原生质体是被去掉纤维素外壁的具有生活力的裸露细胞 1概述 植物原生质体特点：（同植物细胞比较）： 它具有：①易于破裂；②易于彼此直接接触或与异种原生质体接触而发生融合；③易于摄入外界的大分子、细胞器、外源DNA、细菌或病毒颗粒等特点。原生质体是具有潜在利用价值的实验材料，为分离完整的细胞器和大分子，研究质膜，细胞壁再生，细胞融合、遗传转化操作提供了理想的新体系。 原生质体制备：将旺盛生长的植物细胞起来，悬浮在含渗透压稳定剂的高渗缓冲液中，加入适量的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。除去细胞壁碎片的细胞等。 原生质体培养：将植物原生质体在一定条件下培养，经过细胞壁再生而形成细胞，再分裂成细胞团的过程。 1.2 发展简史 1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； 1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体； 1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场； 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。 1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功； （3）理论研究 细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。 因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。 但是必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。 2原生质体的分离、培养  2.1原生质体的分离 (1)取材与除菌 虽然植物体的每一部分几乎都能分离得到原生质体，但生命力强生长旺盛的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响原生质的复壁、分裂，愈伤组织的形成以至植物的再生。 一般以叶片及愈伤组织(包括悬浮细胞)用得较多，未成熟胚及幼穗来源的胚性细胞可能是最有利于分化的材料，这可能是解决禾谷类作物及双子叶植物再生困难的一个途径。取叶片作材料时，—般用刚展开的幼嫩叶片，选用愈伤组织或悬浮细胞作材料时，材料需经短时间继代培养，使细胞处于旺盛生长状态。 对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗 2 3 次，然后浸入 70％酒精消毒后，再放进 3％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。 (2)酶解 机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理 纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase） 对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多 酶液渗透压 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。 其它 酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类 保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力 酶解处理的条件 光：一般黑暗下静止进行； 温度：25℃，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。 原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例） 第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消