第一章 寄生虫抗原.ppt

三.鉴定 1. 抗原组分及化学性质 （1）SDS十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS由一个非极性的疏水区和一个强阴离子基团组成，在有SDS和还原剂存在的情况下低聚物的蛋白质解离成多肽链，各种大小的蛋白质在凝胶中形状相同，所以可以根据电泳的速度来判断分子量的大小。 （2）双向电泳 第一向电泳： 等点聚焦电泳 根据蛋白质的等电点进行分离 第二向电泳 SDS电泳，根据蛋白质分子量的大小进行分离 电源 等电聚焦仪（第一向） 恒温水浴 垂直板电泳仪（第二向） 电源 等电聚焦仪（第一向） 恒温水浴 垂直板电泳仪（第二向） （3）氨基酸序列测定 最终目的是为了合成蛋白或者是多肽，诺氏疟原虫CSP，环子孢子蛋白质，12个氨基酸残基组成的重复结构。 常用有以下3类方法 1.凝胶层析 凝胶层析是一种以分子大小为基础的分离技术，凝胶中每个颗粒的细微结构的小孔使被分离组分在流经途径上出现差别，大分子物质首先从孔外经过，首先被洗脱出来，其次是较小的组分，最后是小分子物质。 常用的载体： 交联葡聚糖 如：Sephadex 瑞典 琼脂糖凝胶 如：sepharoase 瑞典 bio-gel-A 美国 super-Ago-Gel 美国 聚丙烯酰胺凝胶 如：bio-Gel P 美国 2.离子交换层析 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 ?? 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 。 原理： 依靠静电吸引溶液中带相反电荷的离子结合，利用待分离的各种蛋白质的等电点或所带电荷的不同而引起的与载体结合力不同和进行区分。 分类： 阴离子交换剂 阳离子交换剂 阴离子交换剂 纤维载体上结合阳离子基团 如：DEAE纤维素 DEAE sephadex QAE-sephadex 阳离子交换剂 离子交换剂上面带有阴离子 如：CM-纤维素 CM-sephadex 注意点： 要将样品中各组分分别洗脱，必须改变洗脱液的离子强度和PH，以提高解脱吸附的能力。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 完成 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子 考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在碱性pH范围内使用 弱碱型—只能在酸性pH范围内使用 缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性 洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 ?增强洗脱液与离子交换剂的结合力 ?降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱 每收集管中加入2ml茚三酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反应，若生成紫色化合物，则说明收集到氨基酸。 3、亲和层析 亲和层析(affinity chromatography) 　　将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。 原理 　　亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件： ①不溶于水，但高度