第三章_基因工程制药2.ppt

基因文库的筛选 构建基因文库后，就要鉴定出文库中带有目的序列的克隆。 有3种通用的鉴定方法： 用标记的DNA探针进行DNA杂交； 用抗体对蛋白质进行免疫杂交； 对蛋白质的活性进行鉴定 免疫反应法 如果没有DNA探针，还可以用其他方法来筛选文库。例如，若一个目的基因DNA序列可以转录和翻译成蛋白质，那么只要出现这种蛋白质，甚至只需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测。免疫反应法与DNA杂交过程在方法上有许多共同之处 酶活性法 如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子。 第三章 基因工程制药2 生物工程研究所 浙江大学 2009 基因工程载体的定义 如果只有基因，而没有负责运载它的载体基因不可能发挥作用。外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞。 这种能承载体外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。 (B) 基因工程载体 质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 其他载体 克隆载体 表达载体----胞内表达和分泌表达 原核细胞和真核细胞表达载体 根据载体功能分则可分为测序载体、克隆转录载体、基因调控报告载体等。 理想的载体应具备的条件： 具有自我复制能力 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上 具有一个或几个选择性遗传标记 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数 可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中 容易从宿主细胞中分离纯化 质粒载体 质粒（plasmid） 自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1kb到200kb（1kb=1000碱基对）。 质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。 根据质粒能否自己转移，可分为： 接合型质粒：自我转移的质粒，除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因。 非接合型质粒：不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。 pBR 322质粒 是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体。大小为4.3 kb，分子量为4.2?106dal。具有Col EI松弛型复制子，拷贝数为60个/细胞。 pBR 322质粒上有两个选择性标记： ? 氨苄青霉素抗性基因（AmpR）：其上有Pst I的切割位点 ? 四环素抗性基因（TetR）：其上有BamH I、Hind III、Sal I的切割位点 对pBR 322质粒可利用插入失活法进行重组体的选择。例如用BamH I切割后插入外源DNA片段，形成AmpR、TetS，在如下的抗菌素培养平板上进行检验，即可方便的筛选出重组体DNA（红色标记的菌落） PUC系列质粒载体 PUC系列质粒载体 是一类长度约2.7 kb的小质粒，有一个氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。 该类质粒是高拷贝质粒，因为其缺失rop基因，该基因紧靠DNA复制起点，与控制拷贝数有关，所以缺失后拷贝数增多，每个宿主细胞内拷贝数可高达500~700个。 PUC系列质粒带有一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA区段，该区段能编码Lac Z基因产物（?-半乳糖苷酶）的氨基端片段（N端的146个氨基酸），这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并不影响该片段的功能。 多克隆位点： 由克隆实验中常用的限制酶所识别的序列组成，多数情况下这些酶切位点都是单一的，即在质粒载体的其他部位无此切点。这种人工合成的密集排列的系列克隆位点称为“多克隆位点”，也叫 “多接头”，又叫“限制酶切位点库”。 该编码区位于诱导型启动子Plac的下游，用IPTG（异丙基-?-D-硫代半乳糖苷）能够诱导该片段的合成。而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型?－半乳糖苷酶（缺失N端部分序列）实现互补，形成具有酶学活性的蛋白质。 Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体（宿主）与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体（质粒）之间实现基因内互补，这种互补现象称为“?-互补”（基因内互补）。 由?-互补而产生的Lac+细菌易于识别，它们在生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半