利用四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠技术研究.pdfVIP

巾豳商牧兽医学会动物繁殖学分会第十三属学术研讨会论文集 利用四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠技术 李相运 ’ (河北农业大学动物科技学院， 河北傈定071001) 摘要饵倍体胚胎的制备已经成为生物学家研究小鼠以及其它哺乳动物发育生物学的有力工具，目 前，制备小鼠凹倍体胚胎最常用的方法是电融合法，虽然四倍体胚胎不能正常发育，但通过四倍体 胚胎与Es细胞的嵌合可跃得到完全由嚣s细胞发育而来的小鼠，即ES—j、鼠，Es细胞遗传背景的杂 合程度是影响ES小鼠生活力的关键因素，此外，四倍体胚胎的制作方法和遗传背景、ES细胞的生 长状态、嵌合方法、培养基种类、体外培养环境、移植方法、继母母性等都是影响高效获得琵s小鼠 的重要因素。通过蹬倍体胚胎聚合技术可以麓便薅快速地从遗传修饰的杂种Es细胞申获得完全由 Es细胞发育而来的个体，为基因功能和人类疾病动物模型的研究提供了一条有效途径。 关键词小鼠；胚胎干细胞；四倍体胚胎；电融合；‘聚合 小鼠是最为常用的实验动物，也是主要的人类疾病模型动物，而且，小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)的分离建系方法最为成熟。胚胎于细胞是～种高度未分化的多能性细胞，具有长期自 我增殖、自我更新和多向分仡的潜能，能够再生出各种功能细胞和组织器官，已成为现代生命科学 领域中最前沿、最热门的研究课题。通过小鼠ES细胞与四倍体胚胎聚合技术可以简便而快速地从经 过遗传修饰蝻小鼠ES细胞中获得完全由ES细胞发育丽来的个体，即ES小鼠，为研究人类基因功 能和构建疾病动物模型提供了一条有效途径。 1四倍体胚胎补偿技术 在小鼠ES细胞与二倍体胚胎的嵌合体中，ES细胞能参与胚体所有组织的生成；而在四倍体胚 胎与二倍体胚胎的嵌含体中，四倍体胚胎只参与胚外组织的生成[1-3]。四倍体细胞与二倍体细胞在 嵌合体小鼠组织中的严重偏离分布现象已被生物学家应用于许多实验以挽救胚外组织的发育缺陷、 划分遗传不相似组织、快速获得基因突变小鼠以及分析突变基因的表型。如采将ES细胞与四倍体胚 胎嵌合，使二者的发育潜能互相枣}偿，就有可能彳罢到完全由Es细胞发育面来的全体，其胚外组织则 由园倍体胚胎生成，这种技术被称为图倍体胚胎补偿技术(TetraploidEmbryos 生殖能力的成年ES小鼠，并发现小鼠Es细胞遗传背景的杂合程度是影响ES小鼠生活力的关键因素 鼠中，这种技术比克隆技术效率高且更有优势，在蹴生重、胎盘重、生理生化指标等方面，黔小鼠 比克隆小鼠更趋于正常[7]。利用该技术可以简便而快速地从基因打靶的杂种ES细胞中获得完全由 ES缨胞发育丽来的个体，为人类功能基因组研究提供了～条有效途径。羞将四倍体胚胎补偿技术与 克隆技术相结合，可以大大提高以终末分化细脆作为核供体克隆小鼠的效率，且这种小鼠比常规壳 隆小鼠更具生活力[10，11]。 虽然制备ES小鼠的技术早在1990年就已经出现[12]，但至今为止，该技术还没有在国内甚至 国外实验室得到普及和推广，很可能是因为这一技术涉及的操作环节较多，且每一环节的成败都直 接影响着ES小鼠的获缛。现就影响制备ES小鼠的主要因素于予详细说明，目的在于使该技术尽快 在我国得到实际应用。 基金项目：国家自然科学基金(No资助。 作者簏介；李棚运，男，撼士，教授，汉族，1968年11月生，从事胚胎工程与胚胎千细胞研究正作。Email： Tel：0312—7528459。 lixiangyun35@yahoo．com．cn 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三脶学术研讨会论文集 3聚合法制备ES小鼠的基本步骤 2．12一细胞胚胎收集及四倍体胚胎的制各 lOUI。以 雌鼠于下午14：00腹腔注射PMSGIOUI(6：00-18：00光照)；48hr后，腹腔注射hCG l：l的比例与公鼠合笼。次日清晨检查阴道栓。见栓后第2天上午12：00，断颈处死母鼠，打开腹腔， 暴露子宫，将卵巢秘输卵管一并剪下，置无菌培养援中。将注射器默输卵管伞部插入输弗管，冲洗 输卵管并收集2一细胞胚胎。在实体显微镜下剔除未受精的卵母细胞和变性胚，挑选正常的2一细胞胚