利用草鱼原代细胞培养技术测定二恶英的毒性效应研究.pdfVIP

利用草鱼原代细胞培养技术测定二恶英的毒性效应 万小琼2吴文忠‘ 贺纪正2 (1中科院水生生物研究所．武汉。430072；2华中农业大学资环系，武汉，430070) 原代培养是从活体动物获取组织细胞后在体外进行的首次培养．其最大优点是细 胞剐刚离体，生物性状尚未发生很大变化。具有二倍体的遗传性，最接近和反映体内 生长特性，且大多数细胞表现出原有组织的特性，很适合作为毒物测试、细胞分化及 病理学方面的试验研究。原代细胞试验介于活体试验和离体试验之间，使活体试验条 件归一简单化而不失其真实性，使离体试验更接近实际而使实验结果可以直接外推到 活体生物“-““。原代培养技术为建立介于内源代谢和外源代谢之间的生物分析模型 提供了可能性，弥补了离体实验和活体实验的不足。本论文以二恶英为模型化合物， 以7．乙氧基．3．异吩恶唑酮．脱乙基酶(EROD酶)为生物标记物，进行了利用草鱼原 代肝细胞筛选二恶英类内分泌干扰污染物的研究。 材料与方法 1．PCDD／Fs的EROD酶生物测试方法 1．1样品的提取和纯化 准确称取样品1．59，用300mL甲苯索式抽提24小时。样品提取液经旋转蒸发仪 浓缩至lmL左右。然后通过一根多层色谱柱。多层色谱柱先用正己烷湿法装柱，依 次加入加入少量的无水Na，S04，109硅胶，20 g mL正 去活硅胶(4％水。W／W)。顶部加入少量的无水Na2Sq。样品上柱后，用880 343K下蒸发至2-3mL。逐步将该浓缩提取液转入微型 己抗洗脱，洗脱液在550mbar 定量管内．继续用氮气流挥发溶剂。最后加入200／．tl二甲亚砜(DMSO)：异丙醇(4： l，v，v)溶解样品。制备好的试验样品溶液作下一步生物试验用[41。 1，2鱼体肝细胞的原代培养 ‘ 1)试剂 Buffer A：0．145MNaCl，5．4mMKCI，12raMNaHC03，5mM 1．1mM KH，PoI。100mMHEPES，pH7．5。过滤灭菌。 胰酶消化液：0．25％．pH7．2。过滤灭菌。 Hanks洗液：pH7．2·7．4·过滤灭菌。 2)方法 A 用体重约1．5Kg的草鱼为试验材料，去血后取小块肝组织至培养皿中，用Buffer 洗至白色。将肝切成Imm3大小后，用30倍肝重体积的0．25％胰酶消化液消化2·3分 钟，待细胞分散成单个或大量小细胞团时即停止消化。过100目的筛．剩下的组织块 可根据所需细胞数量对其进行再消化。将滤液转入离心管中，1000rpm离心2分钟， 倒出上清液，用Hanks洗液清洗沉淀以除去消化液。晟后将细胞移入培养瓶．加入 DMEM／F12培养基，打散悬浮并计数m“7“l。原代肝细胞的分离制备流程如图l所 不。 鱼 0 肝 去除残留的血 上 国 悬浮 f 离心 厂———] 沉淀物为肝细胞 上清夜含有非实质 性细胞和细胞残渣 图1：原代肝细胞的分离制备流程 1．3原代鱼细胞EROD酶活力诱导生物测试 1)试剂 Tris：50 mM，pH7．4，40C保存。 Tris：50 NaCI，室温下保存。 mM，pH7．8，含0．1M