应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌-大连海洋大学.PDFVIP

维普资讯 第2l卷第 1期 大 连 水 产 学 院 学 报 、ro1．21No．1 2006年3月 JOURNAL0FDAUANFISHERIESUNIVERSITY M丑r．2006 · 研究简报 · 文章编号：1000—9957(2oo6)oi一009／—04 应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌 臧 红 梅 ， 樊 景 凤 ， 王 斌 (1．大连水产学院生命科学与技术学院，辽宁大连116023；2．国家海洋环境监测中心，辽宁大连 116023) 摘要 ：研究了应用斑点酶联免疫吸附试验 (Dot—EnzymeLinkedImmunosorbcntAssay，Dot—ELISA) 技术检测副溶血弧菌V／bro／parahaemolyticus的方法。根据棋盘试验，确定副溶血弧菌免疫血清最佳工 作浓度为1：200，酶标抗体最佳工作浓度为1：100，以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检 测时，副溶血弧菌呈阳性 ，哈维氏弧菌 harveyi、嗜水气单胞菌 Aeromonashydrophila、河流弧菌 fluvlalisbiotype、溶藻弧菌 幽i加{ytfc 、大肠杆菌Escherichiacoli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅 具有快速、经济的特点，而且可用肉眼直接判定结果，适合在基层单位应用推广。 关键词：斑点ELISA；副溶血弧菌；快速检测 中图分类号：R392．33 文献标识码：A 副溶血弧菌 V／br／oparahaemolyticus属于弧菌属，最早是由Fujino等于 1953年从一个食物中毒患 者体内初次分离得到…。该菌是人们最早发现的一种对虾病原菌，它可引发南美白对虾红体病 J。 此外，研究人员还从患病的大黄鱼、斑节对虾、文蛤、中华绒螯蟹体内分离到了副溶血弧菌，并确定 其为病原菌 J。副溶血弧菌广泛存在于海水和海产品中，是引发沿海地区人们食物中毒和急性腹泻 的主要病原菌[．。目前，检测副溶血弧菌主要采用常规的分离培养技术和PCR方法，前者分离培养 病原菌需要时间较长，后者虽然具有特异、敏感等特点，但其步骤繁琐，需要精密仪器设备，不利于 推广应用 J。为此，作者研究了应用简便、直观的斑点ELISA技术检测副溶血弧菌的方法。 1 材料与方法 1．1 材料 试验用副溶血弧菌菌株 (olo7)分离 自患红体病的南美白对虾Penaeusvannamei，通过生理生化 试验和16SrRNA基因序列同源性分析，确定其病原为副溶血弧菌 (病原菌的分离鉴定以及病原性确 定另文发表)。用于交叉试验的哈维氏弧菌 harveyi、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、河流弧菌 V．fluvialisbiotype、溶藻弧菌 alginolyticus、大肠杆菌Escherichiacoli均购 自中国科学院微生物研究 所。硝酸纤维素膜购 自哈尔滨市宝泰克生物科技公司。 HRP标记的羊抗兔 IgG购 自上海华美生物工程公司。副溶血弧菌免疫血清由国家海洋环境监测 中心海洋环境生态室研制。制备过程如下：将浓度约为1X10cfu／mL的副溶血弧菌菌悬液于56℃下 灭活1h，以其作为免疫抗原，选择3只健康的新西兰雄兔 (2kg左右)，在其背部皮下找5个点注 射免疫 (每点注射0．4mL)，免疫分5次进行，每次间隔2周，最后一次免疫7d后，于耳静脉采血， 分离血清，用试管凝集法测定抗体效价及交叉反应效价 】，效价达到1：1280以上即可使用。用哈维 氏弧菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧茵、大肠杆菌菌株进行交叉试验，有交叉反应的菌株 (嗜水气单胞菌、河流弧菌)进行吸附，即在免疫血清中加入过量的已经加热灭活了的该菌细胞，混 匀，在4℃下过夜，离心，取上清液过滤除菌。吸附后的血清经测定如无交叉反应，即可分装，于 收稿 日期：2004-10-22 基金项 目：国家 “863”高新技术研究发展计划项 目 (2002AA639470) 作者简介：臧红梅 (1979一)，女，硕士研究生，E-mail：~mghongmeiqd@163