遗传学Part-14 基因操作.ppt

遗 传 学;一、DNA的热变性 1．G－C含量高的DNA具有较高的熔解温度，可以根据熔解温度的不同将GC含量不同的DNA分子分开，并可推测DNA分子中G－C的相对含量。 2．根据熔解温度的差别在DNA分子中作基因定位和分离基因。;二、互补单链的复性 ?利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突变体的DNA和一个野生型的DNA一起复性后就可确定缺失区。;三、染色体上DNA序列的定位;In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique(FISH);第二节 限制性内切酶; 三、限制酶的特异性 ?1970年，Hamilton Smith从流感嗜血杆菌d株分离到能识别特定核苷酸序列，切点专一的限制酶－HindII。 ↓ 5?－G－T－Py－Pu－A－C－3? 3?－C－A－Pu－Py－T－G－5? ↑ ?Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列的DNA免受HindII的切割： ↓ 5?－G－T－Py－Pu－A－C－3? 3?－C－A－Pu－Py－T－G－5? ↑; ?E.coli的R质粒的一个基因产生的限制酶EcoRI，它对SV40病毒的环状DNA分子上只有一个切点。 --------5?－G－A－A－T－T－C－3?--------- --------3?－C－T－T－A－A－G－5?---------- ?上述序列是旋转对称的。由于切点是错开的，因此使SV40的环状分子切开成具有粘性末端（sticky ends）的线状分子。上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护DNA免受EcoRI的切割。; ?回文序列—palindrome ↓ 5?…… G A A T T C ……3? 3?…… C T T A A G ……5? ↑ ? E. coRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的，称为回文序列—palindrome。从正向和反向阅读是同一句子：西关西、东关东。 ABLE WAS I ERE I SAW ELBA ;几种限制酶的名称和识别序列 ;四、限制酶作图 1．物理图谱：在DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序是一种重要??染色体作图法。从图上任何两个切点之间的距离可估计出核苷酸的数目。 2．方法要点：特定来源的DNA经不同的酶消化后，样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到限制位点的图谱。;图2.2 通过酶切双链DNA，可以确认一种限制酶相对另一酶的切割位点。;A-2100片段可根据两个A切点和一个B切点鉴定。 根据重叠的B-2500片段可将图扩展到右端。 根据重叠的B-1200片段可将图扩展到左端。根据重叠的B-1400片段可将图扩展到右端。 左末端可根据A-1000和B-1200; 右末端可根据A-500和B-1300进行鉴定。;图2.4 若能够鉴别出不同带有末端标记的片段，就可直接确认每种酶与末段的距离。图示一组通过位点毗邻的限制酶消化以后产生的连续伸长的片段。;练习题： 从某一生物的基因组BamHI文库中获得了长3.0kb的片段,如用EcoRI消化该片段获得1.7kb、0.9kb和0.4kb三种片段；如用Hind Ⅲ消化获得1.6kb和1.4kb片段;如用上述两酶混合消化获得1.2kb、0.9kb、0.5kb合0.4kb四种片段。根据上述结果绘制限制性图谱。要求标出EcoRI、HindⅢ和BamHI的位点和它们间的距离。;第三节 DNA重组技术;一般意义上的重组DNA技术专指在细菌细胞中特异性地