重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化和鉴定.ppt

重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化和鉴定 ppt演讲： ppt制作： 组 员： 目录 实验目的 实验背景和主要原理 实验试剂 实验步骤 预期结果 实验目的 了解包涵体内蛋白质分离纯化的基本原理和操作 学习亲和层析的基本原理和操作方法 学习蛋白质含量的测定方法 学习酶活性的测定方法和操作 实验背景和主要原理 甘露醇-1-磷酸脱氢酶(MTLD)是甘露醇类渗透保护剂的生物合成关键酶。 我们组在之前的《基因工程实验技术》课程中构建了甘露醇-1-磷酸脱氢酶表达菌。 成功构建重组表达质粒 pET-28a(+) /MTLD，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，已获得能大量表达生甘露醇-1-磷酸脱氢酶的重组体克隆。 本实验项目为自选课题，主要内容为重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化、鉴定和活性测定。 Fructose-6 -phosphate (F6P) Mannitol-1-phosphate (M1P) Mannitol ATP Fructose Hexokinase (HK) Mannitol-2-dehydrogenase (M2DH) NAD(P)+ Mannitol-1-phosphate phosphatase (M1Pase) Mannitol-1-phosphate dehydrogenase (M1PDH) ADP NAD(P)H Pi NAD+ NADH 渗透保护剂 细胞内蛋白质分离的基本步骤是：清洗细胞、裂解细胞、离心去除膜组分等获得可溶性蛋白质，然后通过盐析、层析等方法进行分离纯化，以获得蛋白产物。分离纯化的情况可用SDS电泳检测。 如果目标产物表达后形成包涵体，包涵体蛋白的分离需要经过细胞破碎、收集包涵体、洗涤包涵体（去除吸附在蛋白质表面的不溶性杂蛋白和其它杂质）、包涵体变性溶解和变性蛋白质的复性等步骤，再进行与一般蛋白质相同的分离纯化。 材料、试剂 1 实验材料 重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶甘油菌（载体pET-28a，受体菌E.coliBL21） 2 实验试剂 咪唑、卡那霉素（Kan）、IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）、去垢剂Triton X-100、低分子量蛋白质Marker 总提取路线 甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达 细胞超声破碎 包涵体的清洗 包涵体的变性溶解 镍柱纯化LDH洗脱条件优化 镍柱纯化LDH 检测方法 蛋白含量测定 酶活性测定 SDS电泳鉴定 甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达 甘油菌 LB液体培养基中培养活化 6h 按1：100接入锥形瓶中培养 IPTG 诱导 4h SDS电泳 卡那霉素 细胞超声破碎 离心15min 蒸馏水清洗3次 收集菌体 Buffer I悬浮 超声破碎40min 离心10min SDS电泳 去上清 上清 沉淀 目的蛋白的存在部位 包涵体的清洗 超声波破碎液 离心10min 沉淀 BufferⅠ清洗 Buffer Ⅱ清洗 沉淀 振荡0.5h （37℃） 离心10min 沉淀 Buffer II清洗 沉淀 蒸馏水清洗 沉淀 注：包涵体变性前必须通过 清洗尽可能去除杂质 去上清 包涵体的变性溶解 清洗后的包涵体沉淀用10mL尿素变性液（50mM Tris-HCl，8M尿素，pH 8.0）悬浮，可用枪把包涵体沉淀吹起来，放在震荡器振荡30min，如果还有未溶的，可以少加些变性液再震荡。等完全溶解后，12000rpm离心20min，留上清，上清直接上Ni柱。 镍柱纯化LDH 镍柱上样前先用Equilibrium Buffer（50mM Tris-HCl，8M尿素，20mM咪唑，pH 8.0）平衡，约三倍柱体积（15mL）。上样。 用2种含不同浓度咪唑溶液15mL进行清洗和洗脱（根据上一步的结果定咪唑的2个浓度），收集洗脱液进行SDS电泳 镍柱纯化LDH洗脱条件优化 镍柱（5mL）上样前先用Equilibrium Buffer（50mM Tris-HCl，8M尿素，20mM咪唑，pH 8.0）平衡，约三倍柱体积（15mL）。上样。依次用6种含不同浓度咪唑溶液15mL进行洗脱，分别收集洗脱液进行SDS电泳 透析复性 方法：复性时使用稀释、透析、过滤及凝胶过滤除去变性剂、还原剂。将变性蛋白连续缓慢的加入到复性缓冲液中。复性中通过透析逐渐减少透析缓冲液中的变性剂浓度。 透析稀释复性方案如下：