体内药物分析 第四章方法的建立与验证.ppt

体内药物分析 第四节 体内药物分析方法 应用示例 第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究 一、文献调研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。 第四章 分析方法的建立与验证 药动学参数 吸收过程—空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%～70% Cmax —口服500mg后平均Cmax为2.4～2.6mg/L Tmax —1～2h T1/2 —血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h 蛋白结合率—0%～40% 代谢—口服给药24h内，40%～50%原形、15%代谢物经肾排出 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内分析方法 RP-HPLC 色谱柱—ODS色谱柱 流动相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.3～3.5)，或离子对色谱: 溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵) 检测—紫外或荧光检测 生物样品预处理 蛋白沉淀法—甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法—二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂 蛋白沉淀-溶剂萃取—乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 二、分析方法设计 1．分析方法 血浆蛋白结合率低(20%～40%)、以原形从肾排泄 生物等效性研究—测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法 2．检测方法 紫外—灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100?l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2?g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求 荧光—灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 3．样品制备方法 初步拟定—采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析 预试—含75%乙腈的提取液100?l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低) 经进一步试验，确定为： 血浆0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取→60℃氮气流吹干→流动相200?l溶解→20?l进样 灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax＞2?g/ml) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 三、实验方案 1．给药方案 20名受试者随机分为两组，每组10人 第1次试验—第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂 第2次试验—第1次服药后第7天开始，两组交换给药 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 2．血样的采集与处理 分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(5～7个t1/2)小时 由肘正中静脉取血 4 ml 立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆，-20℃冰箱中保存待测 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 3．血样分析法 色谱条件 —高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm×4.6 mm，5?m) —流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min —检测波长为?ex=277nm，?em=445nm —柱温为40℃。 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 3．血样分析法 血浆样品的预处理 取血浆0.5ml，加内标溶液(10?g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50 ?l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60℃下氮气流吹干，残渣加流动相200?l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20?l进样 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 四、分析方法验证 1．方法特异性 环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰。志愿者用药后的血浆样品色