血小板膜糖蛋白αⅡbA477PA446P突变对αⅡbβ3复合物表达的影响.pdfVIP

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2018-01-23 发布于浙江
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血小板膜糖蛋白αⅡbA477PA446P突变对αⅡbβ3复合物表达的影响.pdf

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血小板膜糖蛋白αⅡbA477PA446P突变对αⅡbβ3复合物表达的影响

摘要 13 血小板无力症是由于血小板膜糖蛋白aIIb3的基因缺陷引起的血小板对多种诱聚剂的先天性、遗传性无聚集或反应减低。aIIb 133属于整联蛋白超家族的成员，整联蛋白是一组介导细胞黏附的受体蛋白，具有相似的结构特征。为了明确血小板无力症患者的基因缺陷，探讨其分子发病机理，了解特定位点的突变对QIIb133蛋白的结构和功能影响，本论文对一例血小板无力症患者GT-57分子缺陷和发病机理进行了研究。 IIb和133亚基基因的所有45个外通过40对引物对GT-57的Q 显子及其剪接点进行了全长的PCR扩增，然后对PCR产物进行了 II b基因的14号和15号外显子 SSCP．聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现Q 的PCR产物进行了直接测序，发现ⅡIIb基因外显子14发生了点突 IIb亚基变G—C，导致氨基酸密码由GCT-CCT，该突变位于Q IIbA477P 变成脯氨酸(ⅡIIbA477P(A446P))，通过查阅文献资料，Q (A446P)突变系国内外第一例报道，为了进一步探讨该突变到底系多态性位点?抑或是致病突变?如果是致病突变，该突变会对ctIIbp3 复合物表达产生怎样的影响?等等系列问题，我们进行了进一步深入的研究。 II 本研究用重叠延伸PCR法对正常的Q b．pcDNA3．1+质粒载体进行了体外定点诱变，并采用双酶切法将含突变的片段定向克隆至质粒载体，并对Q 结果证实qII 生其他部位基因的突变及丢失。我们用构建的突变Q 的ⅡII b-pcDNA3．1+和133一pcDNA3．1+质粒载体共转染实验为对照。 IIbl3 IIbA477P 本研究比较了转染后的真核细胞内Q 3基因和Q (A446P)B 3基因的表达情况的异同，从转录水平、蛋白质水平和膜表面复合物水平检测了突变体在真核细胞内表达的基本情况。经体 II IIbA477P 外细胞转染实验后，RT-PCR显示正常的Qb和突变的Q (A446P)基因在真核细胞内有转录；免疫印迹实验显示细胞裂解物内有Q IIbl3 仪检测结果显示，正常的Q 3阳性细胞率为77．89％，‘而突变Q II IIbA477P bA477P(A446P)B3阳性细胞率为10．09％，突变的a (A446P)13 IIb133复合 3复合物在细胞膜表面的表达量仅为正常C1 IIbB3复合物表达至细胞膜表面，导致了血小板无力症的发生 II b亚基的13一螺旋结构和最近发 TA等人发表的a 根据Springer 13 V 表整联蛋白Q 3的胞外