融合PCR方法构建马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体.docVIP

精品论文 参考文献 融合PCR方法构建马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体 王琳 蓝秀万（通讯作者）（广西医科大学 广西南宁 530021） 【摘要】 目的 构建马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei, PM）的LIG4基因敲除载体，为敲除LIG4基和后期构建PM高效打靶系统提供基础。方法 通过PCR扩增LIG4基因两翼基因片段及筛选标记基因pyrG基因片段，再用融合PCR方法扩增构建PM LIG4基因敲除载体，并酶切验证。结果 用融合PCR成功构建了以pryG为筛选标记基因的PM LIG4基因敲除载体。结论 马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体构建成功，为进一步同源从组敲除PM的LIG4基因构建高效打靶系统提供基础。 【关键词】 马尔尼菲青霉菌 融合PCR LIG4基因 【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）11-0099-02 由马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei, PM）是唯一温度依赖双相真菌青霉菌，引起人类系统性真菌感染性疾病，主要感染免疫缺陷患者，尤其是HIV感染者，易误诊，死亡率高[1]，近年来其致病分子机制成为研究热点。利用同源从组方法敲除马尔尼菲青霉菌DNA修复关键基因LIG4基因，可大大降低其非同源末端连接，从而提高同源重组效率[2]，构建一个马尔尼菲青霉菌基因高效打靶系统，为其基因功能研究提供有效的遗传操作工具。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒：马尔尼菲青霉菌尿嘧啶营养缺陷菌株SPM4（实验室保存），大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞（TaKaRa 公司），质粒pGEM-T easy（Promega公司)，含有pyrG基因质粒pLAX-223（实验室保存）。 1.1.2 主要仪器：SIGMA台式高速冷冻离心机（仪器型号：3K-15，生产厂家：德国SIGMA），BIOMETRA PCR仪（仪器型号：T personal，生产厂家：德国BIOMETRA），英国UVI凝胶成像分析系统（型号规格：7600Z，生产厂家：日本奥林巴斯公司）。 1.1.3 主要试剂：Pfu酶（Takara），dNTP（Takara），Bio spin胶回收试剂盒（Bio Flux公司），Maxi PCR clean-up kit（天根天根生化科技有限公司），引物合成（上海生工生物工程有限公司）。 1.2 方法 构建策略：设计引物，序列如下：LIG4-1F/LIG4-1R（5rsquo;-ACGG ATGAGATCGTCGGGAC-3rsquo;/5rsquo;-GGACTTTGAGTGTG AGTGGAAATGTGTAACGGCAAAGGAGACTAGTCCAGGCAGCTATC-3/5rsquo;- CCGCAAGACGCTCACGCTTG -3rsquo;），LIG4-2F/LIG4-2R：（5rsquo;-TTGCCGTTACACATTTCC ACTCAC-3rsquo;/5rsquo;-CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3rsquo;），pyrG-F/pyrG-R(5rsquo;-TTGCCGTTACACA TTTCCACTCAC-3rsquo;/5rsquo;—CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3rsquo;)。扩增质粒pLAX-223的pyrG基因和菌株SPM4中LIG4同源基因左右两翼基因LIG4-1和LIG4-2，用融合PCR的方法合成(LIG4-1)一pyrG一（LIG4-2）敲除载体基因片段，转化进入大肠杆菌，蓝白斑筛选,电泳鉴定，酶切检验。 1.2.1 DNA分子操作 SPM4菌总DNA提取、纯化，质粒pLAX-223 DNA提取、转化方法菌参照文献[3]。 1.2.2 融合PCR 融合PCR原理及过程如图1。 第一轮：扩增LIG4基因两翼基因LIG4-1,LIG4-2：LIG4-1F/LIG4-1R：，LIG4-2F/LIG4-2R引物各1mu;，SM4总DNA1mu;l为模板1mu;l，Pfu酶0.5mu;l，PCR程序：95℃times;5min，（94℃times;30s，55℃times;30s，72℃times;6min）times;30个循环，72℃times;10min。 第二轮：扩增pyrG基因：pyrG-F/pyrG-R引物各1mu;，质粒pLAX-223为模板1mu;l，Pfu酶0.5mu;l，P