血管内皮生长因子对脂多糖诱导的胎大鼠肺微血管内皮细胞损伤的调节作用.docVIP

精品论文 参考文献 血管内皮生长因子对脂多糖诱导的胎大鼠肺微血管内皮细胞损伤的调节作用 许向华 于一辰 (中国人民解放军第二零二医院 辽宁沈阳 110003) 【摘要】目的 研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的胎大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvessel endothelial cells，PMVECs) 损伤的调节作用。方法 组织块法培养胎大鼠PMVECs,鉴定。ELISA法检测不同时间和不同浓度LPS作用后PMVECs表达VEGF水平的变化。将胎大鼠肺微血管内皮细胞分为LPS组(加LPS)、VEGF组(加LPS和VEGF)和VEGF抗体组(加LPS和VEGF抗体)。MTT比色法测各组不同时间细胞存活率。ELISA法测各组不同时间血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)、可溶性E-选择素(soluble E-selectin,sE-SLT)的浓度,分别测其与细胞存活率的比值。结果 获得的细胞呈短梭形或多角形,铺路石样排列,第Ⅷ因子相关抗原检测阳性。在作用时间相同的情况下，LPS浓度为0.1至1ug/ml时PMVECs表达的VEGF浓度最高；而不同浓度LPS诱导PMVECs表达的VEGF均在6至12小时达峰值。所有时间点VEGF组细胞存活率都高于VEGF抗体组,但只在24小时以后才有显著性差异。可溶性E-选择素浓度与细胞存活率比在LPS组、VEGF组和VEGF抗体组没有显著性差异,血栓调节蛋白浓度与细胞存活率比亦呈相似的变化。结论 LPS作用后,胎大鼠肺微血管内皮细胞表达VEGF快速达峰然后缓慢下降,其峰值与LPS之间呈现出时间相关性和浓度相关性。VEGF能促进PMVECs增殖,但对血栓调节蛋白和E-选择素的表达没有明显影响。 【关键词】 脂多糖 肺微血管内皮细胞 血管内皮生长因子 E-选择素 血栓调节蛋白 【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）17-0103-03 脓毒症是机体对感染的过度炎症反应,其发病机制复杂,表现多样,除针对病原体进行抗感染治疗外,目前尚缺乏有效的治疗手段。脓毒症的级联式炎症反应、凝血功能激活和纤溶功能受损最终可导致微循环障碍、多器官损伤。脓毒症时有多种病理表现,但普遍存在着毛细血管渗漏现象,这种现象可能与多种炎症细胞、细胞因子参与的发病机制有关。Vander Flier等[1]发现重度脓毒症患者血清VEGF水平较正常对照组明显增高,提示内皮细胞和毛细血管通透性增高可能与VEGF分泌增加有关,但VEGF在脓毒症发病中的潜在作用迄今尚不完全清楚。本研究采用组织块法培养大鼠肺微血管内皮细胞[2,3,4,5],通过研究脂多糖诱导胎大鼠肺微血管内皮细胞VEGF的表达及VEGF对脂多糖诱导的胎大鼠肺微血管内皮细胞的增殖和分泌功能的影响来推测VEGF在脓毒症中的作用。 材料与方法 1 材料 1.1实验动物　雄性Wistar胎大鼠 (2-3天，体重8.1-9.2克，中国医科大学实验动物繁育中心)。 1.2主要试剂及来源　DMEM培养液、胎牛血清、胰酶等购自Gibco公司，血管内皮生长因子ELISA试剂盒购自德国Ramp;D公司，大鼠VEGF、VEGF抗体、Ⅷ因子相关抗原试剂盒等购自武汉博士德生物工程有限公司，E选择素ELISA试剂盒购自上海易利生物科技有限公司、血栓调节蛋白ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，MTT染色剂、脂多糖购自Sigma公司。 1.3主要实验仪器　5%CO2恒温培养箱、Olympus倒置显微镜、超净工作台、低温离心机、分光光度仪。 2　胎大鼠肺微血管内皮细胞分离培养 2.1原代培养 选择出生2-3d健康胎大鼠,颈椎脱位法处死, 75%酒精浸泡全身消毒5min。在超净台内剪开胸腔,自左心室剪一小口,右心室心尖处插入注射器,缓慢推注PBS液原位冲洗肺脏至肺叶变白后取出肺组织浸泡于PBS液中。用眼科剪、镊去除肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不超过1.5mm),再用PBS液反复冲洗后置于干燥的培养皿中,加少许血清后,将肺组织剪成约1.5mmtimes;1mmtimes;1mm大小的组织块,吸取组织块接种到培养瓶内,将培养瓶倒置于37℃、5% CO2的培养箱中,组织贴壁2h后,沿培养瓶侧壁轻轻加入少许DMEM培养液(含20%胎牛血清),以刚没过植块为宜,再正置放入培养箱中继续培养,在倒置显微镜下观察植块贴壁和血