嗜水气单胞菌质粒序列测定.doc

嗜水气单胞菌是鱼类出血性败血症的主要病原，其导致的鱼类疾病持续危害着我国的水产业。目前国际上对于嗜水气单胞菌质粒序列解析已有几篇报道，而国内则鲜见报道；同时，对该菌质粒功能的研究非常缺乏，已有的研究无一例外的将质粒和菌株的耐药性联系起来，却没有完整的将质粒和嗜水气单胞菌的其他特性来进行关联分析，故这样的功能研究难免片面。菌株DBHS101是申请人分离到的一株鱼源嗜水气单胞菌强毒株，含有1个高拷贝质粒（大小约为12 kb）。本研究拟运用克隆测序并拼接的办法获得质粒全序列，并通过生物信息学分析获得质粒的基因图谱；同时，从质粒消除后导致的菌株毒力变化、生态适应能力以及耐药谱变化三方面，系统分析质粒的功能。该研究将加深对嗜水气单胞菌生物学特性的认识，为鱼类败血症的防控提供新的思路。γ变形菌纲，气单胞菌科，气单胞菌属。嗜水气单胞菌广泛分布于各种水体中，是多种水生动物肠道正常菌群的一员；环境胁迫下，它能引起鱼类及其他多种水生动物（包括蛙类、蚌、虾、蟹、部分海水鱼类及绝大多数淡水鱼类）的感染性疾病，是鱼类出血性败血症（也称鱼类暴发病）的主要病原。上世纪80年代末至今，我国水产养殖业就一直饱受由嗜水气单胞菌引起的鱼类败血症的危害。嗜水气单胞菌基因组编码的毒力基因已有多人在研究（Chopra et al., 2009；龚晖等，2003；何鸣筱等，2004；庄培德等，2011），但对于其所携带的质粒解析才刚刚开始，而关于质粒功能，尤其是质粒与细菌毒力是否存在关联的研究还相当缺乏。 已有多篇文献报道嗜水气单胞菌携带有质粒：Ansary等（1992）报道，34株嗜水气单胞菌中有5株检出质粒，且质粒的大小在2.6-6 MDa；Son等（1997）报道，21株嗜水气单胞菌中有7株检出质粒，大小在3-63.4 kb；洪经（2010）报道，40株嗜水气单胞菌中有15株菌检出质粒，而且质粒大小在1.4-5.6 kb。根据NCBI数据库2013年10月21日的记录，已获得的嗜水气单胞菌质粒的全序列共有9个，大小分别为2.5 kb（登录号为NC_021159.1），3.6 kb（登录号为NC_013780.1），6.9 kb（Han et al., 2012c），7.1 kb（Han et al., 2012b），7.6 kb（Majumdar et al., 2011），8.9 kb（Han et al., 2012a），45.9 kb（Kulinska et al., 2008），143.9 kb（Fricke et al., 2009），165.9 kb（Del Castillo et al., 2012）。这些研究都说明并非所有嗜水气单胞菌都含有质粒，但确实有嗜水气单胞菌菌株含有质粒；同时，上述研究无一例外的将质粒和菌株的耐药性联系起来，却没有完整的将质粒和其宿主——嗜水气单胞菌的其他特性来进行关联分析，这样导致的结果很可能对质粒的功能认识不充分、不全面。有研究提示，质粒消除可能伴随生长曲线和毒力发生变化（Majumdar et al., 2006）。故有必要从多方面来研究嗜水气单胞菌质粒的功能。 患病鳙的肾脏分离菌DBHS101是项目组成员在博士阶段分离的一株嗜水气单胞菌，经试验该菌对鳙和鲫的毒力均很强，而且该菌含有1个拷贝数较高的质粒（约12 kb）。本研究将通过酶切后克隆测序和生物信息分析获得质粒的全序列及其编码基因图谱；将从质粒消除后导致的菌株毒力变化、生长速度（或曰生态适应能力）以及耐药谱变化入手，全面系统分析质粒的功能；此外还将重点研究质粒编码的潜在毒力基因的功能。该项研究将为鱼类出血性败血症的预防和控制提供新的思路。 1. 龚晖，林天龙，俞伏松，董传甫，陈日升，杨金先，陈振海。2003. 鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因的克隆及表达。水产学报，27：124-130 2. 何鸣筱，叶巧真，陈诚，谢俊锋，何建国。2004. 嗜水气单胞菌外毒素和外膜蛋白双基因融合表达载体的构建和高效表达。水生生物学报，28：169-173 3. 洪经。2010. 鱼源嗜水气单胞菌质粒的指纹图谱及其与耐药性的关系。上海海洋大学硕士学位论文 4. 庄培德，杨金先，吴学敏，龚晖，林天龙。2011. 鳗源嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及产物粘附功能分析。中国人兽共患病学报，27：112-123 5. Ansary A, Haneef RM, Torres JL, Yadav M. 1992. Plasmids and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from healthy and diseased fish. J Fish Dis, 15: 191-196 6. Ch