超声联合造影剂介导EGFP质粒转染肝细胞的初步探讨.docVIP

精品论文 参考文献 超声联合造影剂介导EGFP质粒转染肝细胞的初步探讨 李鸯1 徐晓红2 （1广州市中医医院超声科 广东广州 510130） （2广东医学院附属医院超声科 广东湛江 524001） 【摘要】 目的 评价低频超声辐照造影剂SonoVue对增强型绿色荧光蛋白（EGFP) 质粒在大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏中表达的作用。方法 造模成功雄性SD大鼠45只，随机分为5组，每组又分为3个亚组，每组3只，分别在1、3、7天麻醉处死取材，制作肝组织冰冻切片后立即在荧光显微镜下观察，采用Image Pro Plus软件计算转染效率。结果 A组、B组、C组切片中均可见少量散在的绿色荧光表达，D组、E组均可见较多绿色荧光蛋白表达，荧光强度增强，各组均在第3天表达最强；在第1、3、7天，A组、B组、C组之间差异统计均无统计学意义（P＞0.05）；D组、E组在3个时间点上与其他组之间差异统计均有统计学意义（Plt;0.05）。结论 超声造影剂在低频超声照射下可以促进EGFP质粒在大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏的转染，通过门静脉注射组（E组）转染效率高于其它组。 【关键词】 超声 造影剂 基因转染 【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）15-0071-02 超声造影剂可增强超声空化效应，导致细胞膜通透性增加。超声辐照能使微泡聚集于某一特定的组织，使治疗物质靶向浓聚，有效地提高转染效率[1][2]。增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)作为一种新型的报告基因，已广泛用于转染细胞的确定、体内基因表达的测定和蛋白质分子的定位。本文选择EGFP基因为标记基因，应用UTMD技术转染肝细胞，并比较经尾静脉和经门静脉不同注射途径的转染效率，以激光扫描共聚焦显微镜观察肝细胞的转染效率。 1 资料和方法 1.1 资料 1.1.1 设备与造影剂 采用GE Logiq 9型彩色多普勒超声诊断仪，使用10L探头（频率8.0MHz），造影时机械指数为0.09。造影剂使用SonoVue（意大利Bracco公司），使用时加入5ml 生理盐水，振摇后形成微泡悬液。 1.1.2 实验动物 SPF级Sprague Dawley大鼠61只，雄性，体质量（200plusmn;20）g，由广东医学院实???动物中心提供。 1.1.3 实验试剂配制 EGFP质粒由美国OriGene公司生产；质粒抽提纯化试剂盒由天根生化科技有限公司生产；大肠杆菌DH5alpha;由广东医学院生化实验室提供。 1.2 方法 1.2.1 动物分组 SPF级Sprague Dawley雄性大鼠61只，造模过程中死亡16只，造模成功45只，随机分为5组，每组9只：A组：EGFP；B组：EGFP+ SonoVue；C 组：EGFP +超声辐照；D组：EGFP+ SonoVue+超声辐照（尾静脉注射）；E组：EGFP+ SonoVue+超声辐照（门静脉注射）。每组又分为3个亚组，每组3只，分别在超声辐照后1、3、7天麻醉处死取材。超声辐照条件：探头4C，频率2MHz，探测深度为6cm，聚焦深度2cm，EGFP质粒注射完毕立即辐照肝区5min。 1.2.2 大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立 实验组大鼠灌喂2-AAF，剂量为每天15mg/kg，连续4天，第5天不灌喂2-AAF，行2/3 肝切除，第六天继续灌胃，连续7天。肝部分切除术(Partial Hepatectomy，PH)：大鼠术前禁食12小时，乙醚吸入麻醉后，仰卧位固定四肢，腹部备皮，常规消毒，在剑突下取腹正中切口，依次切开皮肤，肌层和腹膜，1号手术丝线结扎肝脏左外叶、左内叶和中叶的蒂部，然后切除肝叶，约占全肝2/3，保留右外侧叶、三角叶和乳头叶，观察断端无出血、渗血后间断缝合腹膜关闭腹腔。 1.2.3 门静脉注射方法 PH方法同第二部分，切肝后显露肝门区域，小心分离门静脉的幽门静脉，预置结扎线，将微导管刺入，抽出导丝，注射已配制好的EGFP溶液1.3 mL，将幽门静脉结扎，查无活动性出血，关腹。 1.2.4 EGFP质粒转染效率检测 将新鲜肝组织冰冻切片5～7 mu;m，置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白的情况（激发波长为488 nm、发射波长507 nm）。每个样本选择6 个切片进行观察，每张冰冻切片上随机取5个视野，采用Image