利用MTT法测定丝裂霉素对Hela细胞增殖的抑制效果.docVIP

利用MTT法测定丝裂霉素对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：本实验应用MTT法分析不同浓度的丝裂霉素对HELA细胞的增殖抑制作用。结果表明，丝裂霉素溶液对Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且对Hela细胞增殖抑制作用随着丝裂霉素溶液浓度的增高而增强。 关键词：MTT法，丝裂霉素，HELA细胞，增殖抑制海拉细胞系是被人类乳突状瘤病毒第18型（Human Papillomavirus 18）转化的，和正常子宫颈细胞有许多不同，因其自行繁殖的速度和散步速度比一般癌细胞速度快得多，所以其造成的子宫颈癌的治愈率要比一般癌症更低，严重威胁全球妇女的生存健康。据研究表明，子宫颈癌在全世界范围内发病率和死亡率居妇科恶性肿瘤的第1位，严重威胁着全球妇女的生命安全[1]。子宫颈癌治疗的趋势是采用多种手段的综合治疗，主要为手术、放射治疗、中医药治疗。早期患者以手术治疗为主，辅以中药，预防复发。中晚期则以放射治疗为主，同时结合中医药的治疗，可以减轻放射治疗的毒副作用，提高病人生活质量及病人免疫功能。近年来，国内外开展了化疗作为手术或放疗的辅助治疗以及中医药的治疗取得了一定疗效。丝裂霉素(Mitomycin, MMC)是治疗宫颈癌的重要药物之一[2]，由链霉菌提取，化学结构具有苯醌、乙酰亚胺基及氨甲酰三个活性基团，作用与烷化剂相似，与DNA链形成交联，抑制DNA复制，对RNA也有抑制作用，属细胞周期非特异性药物。抗癌药物体外敏感性试验一直是临床化疗界瞩目的问题。现今已建立了多种肿瘤化疗药敏试验方法，但因成功率低和受试条件限制，都未能在临床推广应用。由Mosman(1983) 建立的MTT显色法是近年来用于验测药物对肿瘤细胞增殖影响的新指标。MTT法具有简便、快速、有一定的特异性等优点，本实验借助体外细胞培养技术，以不同浓度的丝裂霉素刺激人宫颈癌Hela细胞，分析不同浓度的丝裂霉素对Hela细胞增殖的影响。 1、材料与方法[3] 1.1 材料制备 用基础培养液分别配置浓度梯度分别为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml的丝裂霉素液备用。 1.2 实验方法 1.2.1 接种 收集对数期Hela细胞细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3*104/ml，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。 1.2.2 培养与药物处理 培养箱内培养24h，吸出培养液加入不同浓度梯度（1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml）的丝裂霉素液各200 μl，每个浓度接种4孔作为重复实验，以提高实验数据的准确性。同时，设置一个调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），和一个对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），为后面实验做准备。 1.2.3 呈色 培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结晶物充分融解。 1.2.4 比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 1.2.5 计算与分析 按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率＝（未加药物处理的对照组吸光值－药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明药物对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。 2、实验结果与分析 表1 丝裂霉素对HeLa细胞增殖的影响 组 别 对照组 第一组（2.5ug/ml） 第二组（5ug/ml） 第三组（10ug/ml） 第四组（20ug/ml） OD值 0.523 0.243 0.171 0.063 0.055 细胞增殖抑制率 0 53.56% 67.29% 87.90% 89.53% （注：1=0ug/ml,2=2.5ug/ml,3=5ug/ml,4=10ug/ml,5=20ug/ml） 由上表可知，R2值为0.9675，证明数据还是比较具有可信度的。丝裂霉素浓度越高，对应的吸光度值越低，说明丝裂霉素能显著抑制HeLa 细胞生长增殖，降低细胞活性。抑制的效果为：2.5ug/ml＜5 ug/ml＜10ug/ml＜20 ug/ml。计算出各个浓度丝裂霉素对hela细胞的增殖抑制率为53.56%、67.29%、87.90%、89.53%，但丝裂霉素20 ug/ml的浓度对细胞的抑制作用相对前面浓度明显降低了，丝裂霉素对ela细胞的最佳抑制浓度可能在10ug/ml-20ug/ml之间。 3.实验讨论 MTT法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏