重组CYP2C19 酶验证沙利度胺的经酶代谢.docVIP

精品论文 参考文献 重组CYP2C19 酶验证沙利度胺的经酶代谢 李兵（东莞康华医院药剂科临床药学室 广东东莞 511700） 【摘要】 目的 验证沙利度胺在人体内经CYP2C19 酶代谢。方法 将重组CYP2C19- 沙利度胺进行体外孵育，用HPLC 检测沙利度胺的浓度。结果 沙利度胺在灭活的重组CYP2C19 孵育液中孵育后浓度无变化，而在重组CYP2C19 孵育液中孵育后浓度降到检测限以下。结论 沙利度胺在人体内被CYP2C19 代谢得到证实。 【关键词】沙利度胺 CYP2C19 HPLC 沙利度胺（Thalidomide,Thd）沙利度胺1954 年作为镇静药在欧洲上市后，因致婴儿海豹肢畸形及无肢畸形于1964 年撤市。后来发现沙利度胺具有抗炎及抗血管增生作用，被F D A 批准治疗麻风结节红斑和多发性骨髓瘤[1-3]。Ando 等研究后发现沙利度胺经过CYP2C19 酶代谢成活性产物而起作用[4]。CYP2C19 在中国具有明显的基因多态性。为验证沙利度胺是否为C Y P2C19 介导代谢，我们使用了重组C Y P2C19 酶来考察其代谢情况。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 恒温水浴振荡器（SHA-C 型，金坛富华仪器公司生产）；电子分析天平（Sartorius BT 124 S）；pH 计（OAKTON510 型， 新加坡E U T E C H 公司）；HP L C（1525-717-2487， 美国Waters）。重组CYP2C19 酶（BD Gentest 生产）。沙利度胺（Sigma公司, 批号025K4603）。其余孵育体系试剂均采用市售分析纯，HPLC试剂采用色谱纯。 2 实验方法 2.1 主要溶液配制 (1) Tris-HCl 缓冲液的配制：称取适量Tris、EDTA 和DTT，用含有20% 甘油的双蒸水溶解制成含0.1 M Tris，0.1 mM EDTA.，0.1mM DTT 的溶液，用6 M 的HCl 调pH 至7.4。用于肝微粒体的稀释。 (2) 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 的配制： 称取适量K2H P O4，KH2PO4，EDTA 和MgCl2，双蒸水溶解制成0.1 M 磷酸盐, 1 mMEDTA，3 mM MgCl2 的溶液。用于肝微粒体的孵育。 2.2 肝微粒体孵育及孵育液药物浓度检测 重组CYP2C19（50 pM）孵育体系200 mu;l，不同浓度的沙利度胺（0.1mu;g/mL、1mu;g/mL、10mu;g/mL），置于1.5 ml 聚丙烯离心管中，37℃水浴预孵育5 min 后，加入NADPH（10 mu;M）启动孵育反应，60min 后迅速冰浴，并加入冰冷的提取剂（乙酸乙酯）1.0 ml，旋涡振荡2 min, 静置5 min，16000 rpm 离心5 min，转移上清液850 mu;l 至另一1.5 m l 离心管中，于真空干燥器中挥干，残渣用流动相（乙腈- 水（含25mmol/L 磷酸二氢钾, PH 3.5）（15：85，v/v））100 mu;l 复溶，加入内标phenacitin（10mu;g/mL）旋涡混合2 min，16000 rpm 离心3min，取上清80 mu;l 加入样品瓶，进样10 mu;l，流速1ml/min,220nm、248nm 双波长扫描。同时用灭活重组CYP2C19 作一空白对照进行试验。整个实验操作避光进行。 3 结果 沙利度胺在色谱的保留时间为23.5 ～ 25.5 分钟，内标保留时间为28.5 ～ 30.5 分钟。灭活的重组CYP2C19 与沙利度胺孵育后，沙利度胺原型药浓度没有发生改变。而与有活性的重组C Y P2C19 孵育后，三组不同药物浓度的原型药沙利度胺的浓度均降至检测限以下。见下图。 (A) 1mu;g/mL 沙利度胺标准液色谱图（左图220nm 波长，右图248nm 波长） 4 讨论 A n d o 通过实验证实沙利度胺在人体主要代谢酶是C Y P2C19。其5- 羟基代谢产物和5rsquo;- 羟基代谢产物能够抑制血管增生。虽然沙利度胺在人体内的消除主要方式是自发性水解，但其水解产物并不具药物活性。因此有临床意义的途径是经C Y P2C19 代谢。重组C Y P2C19 酶为基因工程人源纯酶，更容易预测药物体内代谢[6]。从本实验???可以看出，与人体血药浓度相近的浓度均能够被C Y P2C19 代谢。其代谢物的浓度和活性的测定有待进一步研究。人体的C Y P2C19 基因多态性势必会影响沙利度胺