Cas9gRNA构建试剂盒（Catalog.No.VK001.PDFVIP

北京唯尚立德生物科技有限公司 Cas9/gRNA 构建试剂盒(Catalog. No. VK001-01) 产品组成 组成 VK001-01S VK001-01L Cas9/gRNA Vector 5T 10T Solution I （2X ） 200μL 200μL Sqprimer(10μM) 50μL 50μL 保存条件: 请将产品于-20 ℃保存，避免反复冻融 产品说明 此试剂盒能快速方便地将gRNA 靶点序列插入到Cas9/gRNA 质粒中。构建好的 Cas9/gRNA 质粒能够同时表达Cas9 蛋白及gRNA，应用CRISPR 技术进行目标 基因的敲除和编辑。 试剂盒使用前gRNA 靶点引物的设计与合成 请按照如下格式设计引物oligo ： Target-Sense：5’-AAACACCG-gRNAsense Target-Anti：5’-CTCTAAAAC-gRNAanti 例如设计的gRNA 的靶点位置为GTCAGTTCTAAATAATGGCATGG (灰色背景：PAM 序列)。 设计下面的oligo，并进行合成：注意：oligo 不能加上PAM 序列 Target-Sense：5’-AAACACCGGTCAGTTCTAAATAATGGCA-3’ Target-Anti：5’-CTCTAAAACTGCCATTATTTAGAACTGAC-3’ 使用方法： 注意：收到试剂盒后，使用前请离心试管，避免溶液残留管壁。 步骤一：oligo 二聚体（oligoduplex ）的形成 将合成的oligo 分别稀释成10μM ，按如下比例混合 Target-Sense1μL Target-Anti1μL SolutionI 5μL H O 3μL 2 最终体系 10μL 混匀后，按照如下程序处理： 95℃3min 95℃到25 ℃缓慢冷却，例如 -1℃/20S 或者将样品管放在95℃水中，自然冷 却至室温 010 order@ 北京唯尚立德生物科技有限公司 16℃5min 步骤二：oligo 二聚体插入到载体中 Cas9/gRNA Vector 1μL 步骤一的oligo 二聚体2μL H2O 7μL 最终体系 10μL 充分混合后，室温（25 ℃）静置5min 步骤三：转化 取步骤二的最终产物5-10μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混 匀，冰浴30分钟后，42 ℃热激90秒，冰上静置2分钟，直接涂于氨苄抗性的平板。 阳性克隆的鉴定 挑3至5个白色菌落摇菌，提取质粒DNA进行测序。测序引物： sqprimer:TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG 。测序结果例子见文档 后。 质粒图谱： 010 order@ 北京唯尚立德生物科技有限公司 测序例子： AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTT AGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAG TAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTA A