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材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填: 2.凝胶色谱柱的装填： 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 * 公布分析发财 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙。 3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气 泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物 质的分离效果。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 * 公布分析发财 装配好的凝胶柱如图5-21 * 公布分析发财 3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 * 公布分析发财 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 课题3 血红蛋白的提取和分离 * 公布分析发财 血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 血红蛋白的特点： * 公布分析发财 一、基础知识: 【思考1 】: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？ 4 、为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？ 5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？ * 公布分析发财 一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 * 公布分析发财 1、原理： 2、材料- 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 凝胶 (一)凝胶色谱法 （分配色谱法）： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 * 公布分析发财 分子量 大 小 直径大小 运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 大于凝胶颗粒孔隙 直径，被阻挡在颗 粒的外面 小于凝胶颗粒孔 隙直径，可以进 入颗粒内部 垂直向下移动 垂直向下移动， 无规则扩散进 入颗粒内部 较快 较慢 较短 较长 先从凝胶柱洗脱 出来 后从凝胶柱洗脱 出来 * 公布分析发财 3、具体过程 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 * 公布分析发财 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 * 公布分析发财 1 、什么是缓冲液？ 2、 缓冲液的作用是什么？ 【思考2 】: （二）、缓冲溶液- 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠， NaH2PO4/Na2HPO4等 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 洗脱剂 * 公布分析发财 3、 缓冲液是如何配制的？ 4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？ 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 磷酸缓冲液 在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正