食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展.docVIP

精品论文 参考文献 食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展 宋丽娟 侯浩 (沈阳铁路局锦州疾病预防控制所 辽宁锦州 121000) 【中图分类号】R155 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）15-0112-01 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM，以下简称单增李斯特菌），广泛存在于自然界，如土壤、污水、青饲料、食品生产加工器具、多种食品。动物和人体也带有此菌[1]，是一种重要的食源性致病菌。该菌具有很强的环境适应性，存活温度范围在-1℃～45℃，PH范围为4.0～9.5，耐盐性相当强，Nacl浓度范围为0.5%～10%，所以在食品加工、生产过程中单增李斯特菌很难被杀灭，而且单增李斯特菌在4℃仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[2][3]。单核细胞增生李斯特菌中毒严重时可引起人类的败血症、脑膜炎及单核细胞增生等多种疾病，死亡率高达35%～70%[4]，所以对实验室检验人员来说，提高单增李斯特菌的检出率具有重要的现实意义。 食品中单增李斯特菌的检测方法大致分为三类，即分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。 1 分离培养法 是最传统的检测方法，应用国标法，即GB/4789.30—2010作为检测方法，先两次增菌，即LB1增菌液36℃plusmn;1℃培养24小时，然后再移取到LB2增菌液36℃plusmn;1℃培养18～24小时，对被检样品进行增菌，然后取LB2增菌液划线接种在科玛嘉李斯特菌显色培养基和PALCAM琼脂平板，36℃plusmn;1℃培养24～,48小时，然后经初筛鉴定等试验步骤，结果符合生化试验和溶血试验结果进行报告，但该菌革兰氏染色和镜检时要特别加以注意，因为单增李斯特菌在新鲜培养液为G+小杆菌，但在陈旧的培养液中菌体多转为G－,特别是该菌在22℃～25℃环境中能形成4根鞭毛，运动活泼，在32℃环境中仅能形成1根鞭毛，运动缓慢，在36℃培养则无动力，所以容易误判。虽然该方法实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6～7d，这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检验要求 [5]。特别是在菌浓度较少时容易漏检而呈假阴性[6]。目前，应用API（Analytic Products INC）进行生化试验，虽然缩短了检测时间，但由于API在反应颜色变化时，颜色深浅有一定的局限性，使其在判定结果上存在一定的主观性，而且成品较高。 2 免疫学方法 免疫学检测技术主要是基于抗原和抗体反应来检测食品中的致病菌，目前已有的检查方法有：酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶联荧光分析法（ELFA）、放射免疫法、免疫扩散等，目前，从食品中检测单增李斯特菌免疫学方法主要是ELISA技术。ELISA技术具有操作简便快速等特点，但特异性较差。 ELISA原理是基于抗原、抗体能吸附在固相载体的表面，底物经酶催化而产生有色物质，判定结果时用肉眼观察或分光光度计分析测定显色底物，从而判定被检样品中是否有相应的抗原或抗体。ELISA包括：直接ELISA，夹心ELISA和竞争ELISA。段霞等[7]应用双抗夹心ELISA方法检测食品中单增李斯特菌，可根据有色物质的颜色反应进行分析，但因ELISA技术难以进行李斯特菌种间特异分析，增加了单增李斯特菌假阳性结果的几率。随着科学技术的发展，近年来，检测单增李斯特菌多采用PCR技术。 3 分子生物学方法 由于分子生物学技术的不断发展，其相关的检测方法，如PCR技术、实时荧光PCR等在单增李斯特菌的检测研究中得到了应用。 3.1 传统的PCR检测方法 PCR技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，已应用于感染性疾病的病原体的检测。但由于传统的PCR方法易产生假阳性，又不能准确定量等缺陷，研究者们对PCR检测技术进行了多方改进，在传统的PCR检测方法基础上，运用荧光定量PCR技术检测单增李斯特菌，实现了PCR从定性到定量的研究进展。 3.2 荧光定量PCR技术 荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。PCR的改进技术与传统的PCR技术相比具有明显的优势，是近年发展的新技术。该技术克服了传统的PCR技术易污染、不能定量、灵敏度不高等缺陷，同时弥补了分离培养检测周期长、检出率偏低等不足。研究表明，实时荧光定量PCR技术用于检测单增李斯特菌较传统的PCR检测具有灵敏度高、特异性强等优点。张合