食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用分析.docVIP

精品论文 参考文献 食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用分析 梁聪 　　（苏州市姑苏区疾病预防控制中心 江苏 苏州 215007） 　　【摘要】 目的：探讨食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制，并对其应用价值进行详细分析。方法：分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种食源性致病菌进行多重PCR检测，设计三种特异性引物，对其进行菌多重PCR检测，分析其应用价值。结果：三种菌固定模板浓度为10-7，可将其优化为三重PCR检测试剂盒，经过相关调试，结果显示，PCR检测试剂盒扩增条件相符，能够进行同时使用。结论：多重PCR检测试剂盒具有使用便利、灵敏度高、特异性强等优势，将其用在食源性致病菌检测工作中，可及时发现食品安全隐患，是安全检查的核心技术，值得加大研究力度。 　　【关键词】 食源性致病菌；多重PCR检测；试剂盒 　　【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）18-0374-02 　　准确、快速检验食源性致病菌，能够控制致病菌感染和传播。本研究主要目的为探讨食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制方法，并对其使用价值进行探究，现将研究结果做出如下汇报。 　　1.材料与方法 　　1.1 材料来源 　　本研究试验菌株来自菌种库，部分则来自实验室分离保存品，所有供研究所用的菌株均要首先进行API（或ATB）细菌鉴定，然后进行正确保存。试剂：营养琼脂、营养肉汤、细菌DNA提取试剂盒、TES缓冲液；仪器：多重PCR检测仪、电泳仪、光度计、凝胶成像系统（以上均由美国公司提供）。 　　1.2 试验方法 　　细菌培养：分别取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种食源性致病菌3株标准菌株，将其接种法在营养肉汤的培养基中，在温度为37℃的培养环境中进行过夜培养。采用细菌试剂盒对三种食源性致病菌基因组DNA进行提取，并使用光度计对其浓度进行准确测定，分别保存在-20℃的环境中。主要操作程序：取1mL培养物放置于离心管内，以10000r/min速度对其进行离心处理，时间控制在5min，撇去上清液，采用TES缓冲液（500mu;L）对沉淀物进行洗涤，有效洗涤2次后撇去上清液。在离心管中加入TES缓冲液（200mu;L），同时使菌体在100℃的环境中进行水浴处理，时间为15min。裂解处理后将细菌基因组的DNA释放出来，后在4℃环境中以13000r/min速度离心处理10min，得到的上清液要保存在-20℃的温度下备用[1]。 　　1.3 引物设计方法 　　根据金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种食源性致病菌基因序列，设计出具有特异性、多重性的PCR检测引物，详细情况见表。 　　2.结果 　　2.1 特异性、灵敏度评价 　　对所设计的三对引物进行多重PCR检测，结果显示，三对引物均可扩增出目的基因的条带，且三种细菌均未产生非目的性条带，说明三对引物设计合理，且具有较强的灵敏度，同时具备特异性；与此同时，三种菌固定模板浓度为10-7，可将其优化为三重PCR检测试剂盒，经过相关调试，结果显示，PCR检测试剂盒扩增条件相符，能够进行同时使用。 　　2.2 试剂盒试验结果 　　将试剂盒1保存在-20℃的环境下30d，试剂盒2保存在-20℃的环境下60d，试剂盒3保存在-20℃的环境下90d，并对标准质粒进行检测，1-3试剂盒均进行3次重复测定，结果显示：3个试剂盒检测标准质粒试验结果均呈阳性，且条带亮度未发生明显变化。说明试剂盒具有较好的重复性，能够在-20℃的环境下保存90d以上，具有较高的稳定性，不会对检测结果产生影响。 　　 　　3.讨论 　　现阶段，食品安全问题越来越受到人们的重视，食源性致病菌是造成食品安全问题的主要病菌，采取必要措施对其进行防控，能够预防食源性食品问题[2]。研制多重PCR检测试剂盒，并将其有效应用在食品检测中，是目前食品安全检查的重点。多重PCR检测技术由普通检测技术发展而来，具有操作方便、成本低廉等优势，同时其自身的灵敏度较高，且检测速度快，具有良好的应用价值。同时，对不同食品进行细菌检测，试剂盒本身的灵敏度不会受到影响[3]。 　　本研究主要目的在与探讨多重PCR检测技术对三种食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌）的检测结果，进而说明食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制过程，并对其应用价值进行分析。 　　本研究以分子生物学相关原理为基础，对细菌靶基因的正确选择进行相应检测，试验过程中，要重点关注多重PCR检测技术自身的特异性，同时重视引物设计的科学性。研究结果显示：三对引物设计科学合理，具有较强的灵敏度，PCR检测试剂盒扩增条件相符，且试剂盒能够长期保存，检测结果不会因此而受到