食物中毒中LAMP法快速检测金黄色葡萄球菌的研究.docVIP

精品论文 参考文献 食物中毒中LAMP法快速检测金黄色葡萄球菌的研究 李文龙 张烜榕 颜军 李桂满 侯敏 卜舒 魏茂琪（昆明市疾病预防控制中心 云南昆明 650028） 【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）51-0112-02 【摘要】 目的 通过一起疑似金黄色葡萄球菌食物中毒的病原菌检测方法比对，探讨在食物中毒中Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法快速检测的应用。方法 应用LAMP法进行快速检测，并用国标GB 4789.10-2010法和Real-time PCR法检测进行比对。结果 LAMP法与国标GB 4789.10-2010法、Real-time PCR法结果一致，均为从1份病人呕吐物和1份厨房用具涂抹样中检出金黄色葡萄球菌，肠毒素检测为B+C型。结论　该起食物中毒是由金黄色葡萄球菌肠毒素引起，LAMP法快速灵敏，是一种适用于基层实验室金黄色葡萄球菌食物中毒的快速检测手段。 【关键词】 LAMP 金黄色葡萄球菌 食物中毒 金黄色葡萄球菌是食品安全国家标准食品微生物学检验常规检测项目之一[1]，是常见的食源性致病菌。由于致病金黄葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦污染食品，在适宜的温度环境下大量繁殖，产生的肠毒素随污染食品进入人体后引起食物中毒。 2012年4月18日，昆明市某酒店7名顾客在就餐2h左右后，相继出现呕吐、恶心、腹痛、腹泻等急性肠胃炎症状。根据现场流行病学调查以及实验室检测结果分析是由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。 1 材料与方法 1.1 标本来源 昆明市疾病预防控制中心共采集标本42件，其中患者呕吐物1件，肛拭子7件，剩余食品22件，工作人员手部涂抹样3件，厨房用具涂抹样9件。 1.2　仪器与试剂　恒温培养箱，VITEK-32全自动微生物鉴定系统，恒温水槽，ABI 7500 Real-time PCR仪；7.5%氯化钠肉汤，Baird-Parker平板，血平板，BHI肉汤，兔血浆，VITEK GPI鉴定卡，金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（环介导恒温扩增法）（广州华峰生物科技有限公司），金黄色葡萄球菌检测试剂盒（实时荧光PCR法）（深圳市生科源技术有限公司），金黄色葡萄球菌肠毒素三合一金标快速检测卡（北京路桥技术有限责任公司）。 1.3 检测方法 病原菌检测同时采用GB 4789.10-2010法，LAMP法和Real-time PCR法；金黄色葡萄球菌肠毒素检测采用双抗体夹心法及免疫层析分析技术。 1.3.1　GB 4789.10-2010法检测　按GB 4789.10-2010法操作。①增菌：称取25g 标本至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋中（呕吐物、肛拭子、工作人员手部涂抹样及厨房用具涂抹样直接接种于10mL7.5%氯化钠肉汤），均质器混匀后于 36℃培养24h。②分离：分别划线接种到血平板和Baird-Parker 平板，血平板36℃培养24h，Baird-Parker平板36℃培养48h。③鉴定：挑取可疑菌落染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜；血浆凝固酶实验结果为阳性。可疑菌落同时用VITEK GPI鉴定卡进行生化鉴定。 1.3.2　Real-time PCR法检测　依试剂盒说明操作，将采集标本按GB4789.10-2010法进行增菌处理后，取1mL增菌液12000r/min离心5min收集菌体， 加入DNA提取液50mu;L，混匀后100℃加热处理5min，12000r/min离心2min。上清液用于Real-time PCR检测。Real-time PCR检测：在已分装的20mu;L反应体系中加入对应的上清液5mu;L 。Real-time PCR反应条件为：UNG处理（50℃，2min，1个循环）rarr;预变性（95℃，3min，1个循环）rarr;Real-time PCR（95℃，5s；55℃，60s，40个循环）。标本Ct值le;25，有明显指数增长判阳性；Ct值＞35或无Ct值为阴性。 1.3.3 LAMP法快速检测 按试剂盒说明书操作，具体如下：将采集标本按GB 4789.10-2010法进行增菌处理后，用1mL增菌液10000r/min离心2min收集菌体，加入DNA提取液80mu;L，混匀后沸水浴10min，冰浴10min后10000r/min离心2min。上清液即为核酸模板。LAMP检测：在已分装好的HF反应管内加入上述待检模板2.5mu;L，置