高脂食物与乙醇对小鼠肝纤维化的建模研究.docVIP

精品论文 参考文献 高脂食物与乙醇对小鼠肝纤维化的建模研究 1.长沙医学院2013级本科临床6班 湖南长沙 410219；2.长沙医学院解剖学教研室 湖南长沙 410219 摘要：目的：研究高脂饮食和乙醇对肝纤维化的影响。方法：40只雄性小鼠随机分为4组，空白对照组小鼠自由饮水，予正常饮食，并予以 CCL4皮下注射；高脂低酒精模型组小鼠，予高脂食物喂养，低容量酒精灌胃，并且予以 CCL4皮下注射；高脂高酒精模型组小鼠，予大容量酒精代灌胃，予高脂食物喂养，并且予以 CCL4皮下注射；高酒精模型组小鼠，予大容量酒精代灌胃，并皮下注射植物油并且予以 CCL4皮下注射。观察各组建模动物的饮食、体重、皮毛，活动情况、精神状态的状态，用光镜观察肝纤维化病理情况，检测建模动物的各项生化指标，利用超声成影技术对大鼠肝纤维化程度进行观察。结果：高脂高酒精组的小鼠的体重一开始上升的较快，但是之后速度逐渐减慢，甚至呈下降趋势，hyp明显升高。 关键词：高脂食物；乙醇；肝纤维化；实验动物建模 1实验材料 18-20g的成年健康雄性小鼠40只，市售饮用白酒（四川省古郎酒厂有限公司生产的郎酒，酒精度45％），离心机，光学显微镜，高脂饲料（玉米粉94.5％+猪油 5.0％ +胆固醇0.5％），灌胃器，注射器，四氯化碳溶液。 2.实验方法 2.1实验动物的分组与处理 清洁级饲养，1 周适应期后随机分为4组，分别给予以下处理：①空白对照组小鼠自由饮水，予正常饮食，并予以 CCL4皮下注射；②高脂低酒精模型组小鼠，予高脂食物喂养；③低容量酒精灌胃1ml/100g，并且予以 CCL4皮下注射④高脂高酒精模型组小鼠，予大容量酒精灌胃2ml/100g，予高脂食物喂养，并且予以 CCL4皮下注射。 2.2 标本采集及检测方法 2.2.1．标本的收集：隔夜禁食12 h，不禁水，于次日获取全血标本后颈椎脱臼法处死小鼠。全血标本于4℃冰箱静置1 h后3000 r/min离心10min分离得到血清，用于血清学指标的检测。处死大鼠后立即取出肝脏，称取肝脏湿重，在肝脏最大叶距边缘5 mm处取小块肝组织，10％甲醛溶液固定，石蜡包埋，病理切片，HE染色及天狼星染色（sirus），光镜观察。肝脏病理学：造模后不同组别、不同阶段的小鼠肝脏病理变化，包括脂肪变性、炎症，纤维化情况。肝组织病理学检测 将取下的肝组织标本用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，包埋，制作成5 mu;m厚切片，HE染色，光镜下观察。HE染色由山东省立医院病理科专家盲法阅片，分别在低倍镜（times;10）、高倍镜（times;40）下观察肝组织的病理学改变。肝细胞脂肪变性的程度判断标准参照范建高及Elizabeth等[1，2]。 天狼星红染色（sirus）制作方法：先取出培养箱内的CFs培养板，取出爬片标记；再磷酸缓冲液（PBS）洗，5mintimes;3次；接着用4%多聚甲醛固定15min；再用PBS洗，5mintimes;3次；用天青石蓝液染5-10分钟；再用PBS洗5mintimes; 3次；接着苦味酸天狼星红液染15-30分钟；再用PBS洗5mintimes; 3次；继续苏木精复染5-10min；再用90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脱水；接着用二甲苯透明，中性塑胶封固；最后倒置显微镜下观察结果并照相保存。染色结果I型胶原呈亮红色或黄色，III型胶原位于I型胶原的周边呈绿色。 2.2.2检测指标 2.2.2.1 超声造影（CEUS）：经小鼠尾静脉以团注方式注射0.06ml微泡混悬液，后推注1.5ml生理盐水。 2.2.2.2生化指标 取小鼠肝脏检测丙二醛（MDA），硫代巴比妥比色法川；谷胧甘肤，二硫对硝基苯甲酸法[3]；金属硫蛋白（MT），镐饱和原子吸收分光光度法川；羟脯氨酸（HYP）[4]。 2.2.2.3病理学指标取肝左叶同一部位组织，常规HE染色及Masson染色，光镜观察，并[5]肝组织常规脱水、包埋、切片常规做HE染色，观察肝组织病理学改变；Masson染色用半定量标准判断胶原纤维增生程度。天狼猩红染色后I型、Ⅲ型胶原纤维胶原纤维呈红色，其余组织呈黄色。运用Image-proplus5．0图象分析软件半定量计数肝组织胶原面积，每组随机取5个视野，通过比较各组肝组织的纤维化指数（FI）值评价肝纤维化程度。FI=纤维染色区面积／整个视野面积times;100％，最后进行评估。 制定胶原纤维增生程度半定量标准：（一）表示无明显胶原纤维增生；（+）表示胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少