第七章 基因治疗PPT.pptVIP

第十七章 基因治疗;1990.9.14 美国国立卫生研究院（NIH）的布雷斯和安德森 首例基因治疗 4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID) 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能 ADA基因 LN逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞;第一节 概 述;一、基因治疗的概念;二、基因治疗的必要条件;㈠基因标记(gene labeling);㈡基因置换（基因矫正）;㈢基因添加（基因增补）;(四)基因干预(gene interference); 第二节 基因转移技术和靶细胞;1.体内直接转基因 体内法 ( in vivo) 2.体细胞介导的基因治疗 回体法 ( ex vivo);基因转移的方法：;一、基因转移的生物学方法;2.包装细胞(packaging cell);;3.逆转录病毒载体的特点：;4.安全性问题;①逆转录病毒感染的可能性;②污染的可能性;③逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合;二、基因转移的非生物学方法;㈠脂质体( liposome );3.脂质体介导基因转移的方法;4. DNA-脂质体混合物与细胞膜的作用方式;5.人工脂质体膜的特点：;㈡直接注射;㈢受体介导基因转移技术;;方法：;例：;㈣其它方法;三、基因转移的靶细胞;目前常用的靶细胞有：;第三节 反义RNA、核酶、三链DNA、RNAi在基因治疗中的作用 ;一、反义RNA; 利用反义RNA进行基因治疗的方法： 体外合成反义RNA，注射细胞 构建转录反义RNA的重组质粒，转入细胞 问题： 1.降解 2.非专一性;㈡受体介导反义RNA转移技术;二、核 酶;;;三、三链DNA;;;四、RNA干扰; RNA干扰是由双链RNA诱导的。在细胞内，双链RNA(dsRNA)前体由核酸酶III(RNase III)－Dicer处理为21一23个碱基的小RNA，才能诱发RNA干扰。因此，称这类小RNA为小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)。小干扰RNA是由21-23个碱基配对形成的双链，并在其3’末端有两个游离未配对的核苷酸。它与解螺旋酶、核酸酶等结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducing－silencing complex, RISC)后，能引导RISC与互补mRNA结合，将mRNA降解。; * dsRNA 的核酸酶 属于RNase III 核酸酶家族成员，称为Dicer，是一种ATP依赖性核酸内切酶。它包括2 个催化区、1个解旋酶区及dsRNA 结合区域，在进化过程中高度保守。该酶将dsRNA切割成长21-23 nt, 此片段的3`端有2nt的突出尾。 * RNA诱导的沉默复合物 称为RNA-induced silencing complex (RISC)，复合物由21-23 nt dsRNA、核酸酶和mRNA。当RISC 复合物形成，核酸酶降解mRNA。;　(一)ＲＮＡ干扰的历史;　　　20世纪90年代，Arizona大学的Rich Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花的紫色，就将一个强启动子控制下的色素基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不是紫色而是杂色，甚至是白色。转基因的植株不仅没有新基因的表达，反而使原有的色素基因表达也受到了抑制. Rich称这种现象为共抑制（cosuppression），即转入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制--出现基因沉默（gene silencing）. ;　　　1995年，美国康乃尔大学的Su Guo博士 和Kemphues试图利用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因，但却得到了一个意想不到的结果。在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。当时Guo等没能给出合理的解释. ;;　　直到1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fir 和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello等首次揭开这 个悬疑之谜。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑 制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基 因表达的阻断，都是由于RNA中污染了微量双链 RNA而引起。当他们将单链RNA纯化后注射线虫时 发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双 链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的 表达，他们将这一现象称为RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。;(Fire, 1998);;(三)RNAi作用的原理：;