医学论文-环巴胺对胃癌细胞BGC- 823增殖凋亡及Shh、Gli- 1基因表达的影响.docVIP

医学论文-环巴胺对胃癌细胞BGC- 823增殖凋亡及Shh、Gli- 1基因表达的影响 ???????????作者：任雪萍，姜藻，刘飞，顾晓怡，高峰 【摘要】? 目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC- 823增殖凋亡及Shh、Gli- 1基因表达的影响。方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC- 823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT- PCR检测Shh、Gli- 1 mRNA的表达情况。结果:环巴胺可明显抑制BGC- 823细胞的生长,呈时间剂量依赖性，并出现典型的细胞形态学改变；经32、64、96μmol ·L－1的环巴胺作用24h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、 56.10%，明显高于空白对照组的2.10% (均P0.01)；Shh及Gli- 1 mRNA均表达，环巴胺可下调Gli- 1 mRNA表达，但对Shh mRNA表达无明显影响。结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC- 823增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Gli- 1基因表达有关。 【关键词】? 环巴胺； 胃癌细胞； 细胞凋亡； Shh； Gli- 1； 基因表达 ??? 环巴胺(cyclopamine)是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，因其致畸作用而于20世纪60年代被发现。1998年，环巴胺作为一种Hedgehog信号通路的阻断剂在果蝇体中得到证实［1］。最近研究发现,Hedgehog信号通路的异常激活可能与胃癌的发生发展有关［2］。目前国内外关于环巴胺与胃癌的关系研究较少。本实验旨在研究环巴胺对胃癌细胞系BGC- 823的体外生长抑制及诱导凋亡作用，并进一步探讨其可能的作用机制。 ??? 1? 材料和方法 ??? 1.1? 材料 ??? 人胃癌细胞系BGC- 823由解放军第八一医院全军肿瘤中心惠赠，环巴胺购自Biomol公司，RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、AO/BE试剂盒购自Sigma公司，Annexin Ⅴ- FITC /PI试剂盒购自BD公司，β- actin及Shh、Gli- 1基因引物由Invitrogen公司合成，RT- PCR试剂盒购自TaKaRa公司；酶标仪为BIORED 550型，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型。 ??? 1.2? 方法 ??? 1.2.1? 细胞培养? BGC- 823细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5 % CO2 饱和湿度的培养箱中培养，每3～4d传代1次。 ??? 1.2.2? MTT法检测细胞生长抑制效应? 取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞,孵育过夜后，加入终浓度为2.5、5、10、20、40、60、80、100μmol·L－1的环巴胺，另设空白调零组、阴性对照组，每组设3个复孔，分别培养24、48、72h，用MTT法测每孔光密度值(OD570值)。抑制率=(1-药物组平均OD570 值/对照组平均OD570值)×100%［3］。 ??? 1.2.3? 倒置显微镜观察? 上述各组细胞于倒置显微镜下直接观察细胞形态学变化。 ??? 1.2.4? AO/EB染色荧光显微镜观察? 收集环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，制成浓度为1×107ml－1细胞悬液，取200μl细胞悬液加8μlAO /EB染液混匀，吸10μl混合液点于洁净载玻片上，盖玻片封片后，于荧光显微镜下观察，按试剂盒说明书进行结果判断。 ??? 1.2.5? Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率? 收集经32、64、96μmol·L －1 环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，用PBS洗涤2次,采用AnnexinⅤ和PI荧光染色流式细胞术定量分析细胞凋亡率。 ??? 1.2.6? RT- PCR法检测Shh、Gli- 1mRNA表达? 收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RT- PCR操作。Shh：上游引物为5′- GCGACTTCCTCACTTTCCTG- 3′,下游引物为5′- CCGGTTGATGAGAATGGTG- 3′；Gli- 1：上游引物为5′- AGGAGTTCGTGTGCCACTG- 3′，下游引物为5′- GGCAT TGCTGAAGGCTTTAC- 3′；内参为β-actin。RT- PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。 ??? 1.3? 统计学处理 ??? 实验所得数据以x-±s表示，利用SPSS13.0软件处理包进行统计分析。多组间的比较采用单因素方差分析；采用Probit回归分析计算半数抑制浓度（IC50），检验水准α=0.05。