医学论文-溶酶体cathepsin B参与大黄素诱导HK2细胞凋亡.docVIP

医学论文-溶酶体cathepsin B参与大黄素诱导HK2细胞凋亡 ?????????? 作者：王翠芬，陈敏，吴旭东，孙立新，严明，张陆勇? 【摘要】? 目的：研究大黄素对人肾小管上皮HK2细胞的细胞毒性及其机制。方法：用MTT法检测经0～100 μmol·L-1浓度大黄素作用后HK2细胞的活力，透射电镜观察细胞核形态的改变，流式细胞仪检测亚二倍体细胞比例，用特异性的底物分别测定caspase 3和cathepsin B的活性。结果：大黄素可引起HK2细胞死亡，并伴有亚二倍体细胞比例的增加和核浓缩、染色体边集等形态的改变，在引起HK2细胞凋亡的浓度下caspase 3活性增加，而用caspase 3特异性抑制剂AcDEVDCHO可抑制上述改变。在诱导HK2细胞凋亡的剂量下大黄素使cathepsin B表达及其活性升高，cathepsin B特异性抑制剂CA074能拮抗大黄素诱导的caspase 3活性升高,恢复HK2的细胞活力。结论：大黄素在体外主要以caspase 3 依赖方式引起HK2细胞凋亡，cathepsin B参与了此过程。 【关键词】? 大黄素; HK2细胞; 凋亡; caspase 3; cathepsin B ??? 大黄素（emodin）为蒽醌类化合物，具有导泻、调节免疫、抗菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。1996年Marchant报道大黄素具有肾毒性；2001年美国NTP报道，大黄素可引起实验动物（大鼠和小鼠）肾小管细胞玻璃样变、色素沉着，增加雌性小鼠肾病发生率。我们以往的实验也证实中药大黄对肾脏有损害，并已有初步证据表明，大黄素作为大黄的主要生物活性成分之一起着主要作用，但其损害机制还不清楚。本实验首先在体外观察大黄素对来源于人肾小管上皮细胞的HK2细胞的直接作用，并探讨大黄素引起HK2凋亡的主要途径和可能机制。 ??? 1? 材料和方法 ??? 1.1? 细胞培养及相关试剂 ??? HK2细胞购自ATCC,置于含10%胎牛血清的DF12(DMEM∶F12=1∶1)培养基中，在37 ℃、5%CO2孵育箱中培养。大黄素购自江苏省药品检验所。caspase 3的显色底物AcDEVDpNA、caspase 3特异性抑制剂AcDEVDCHO、cathepsin B的荧光底物ZArgArg7amido4methylcoumarin hydrochloride、特异性抑制剂CA074［N(13transpropylcarbam oyloxirane2carbonyl)1isoleucyl1proline］均购自Sigma。抗人cathepsin B抗体及二抗均购自Upstate Biotechnology。 ??? 1.2? MTT法测定细胞活力 ??? 取对数生长期HK2细胞,以5×104终浓度接种于96孔培养板,加入不同浓度(0～100 μmol·L－1)大黄素,作用一定时间后每孔加入20 μl MTT，再孵育4 h。在酶标仪570 nm波长处读取吸光度(A)值。每样本重复3个孔,每个实验重复3次,取平均值。 ??? 1.3? 透射电镜观察细胞核的形态改变 ??? 分别用不同浓度大黄素处理细胞后，固定，脱水，包埋，最后制成超薄切片，在透射电镜(JEM 2000)下观察并照相。 ??? 1.4? 流式细胞仪检测 ??? PI单染：细胞经大黄素处理后分别收集(106 ml－1)，用预冰冷的PBS洗2遍，在-20 ℃用70%的乙醇固定至少1 h，弃去固定液后再洗2遍，0.5 ml PI染液染色，4 ℃避光10 min，上流式细胞仪检测，分析亚二倍体细胞比例。 ??? Annexin Ⅴ/PI 双染：HK2细胞经不同处理后收集(106 ml－1)，与Annexin Ⅴ/PI 试剂避光孵育30 min，上流式细胞仪检测，分析早期和晚期凋亡细胞比例。 ??? 1.5? caspase 3活性测定 ??? 收集处理过的细胞 1×106，PBS洗涤，制备细胞裂解液加 AcDEVDpNA（caspase 3四肽显色底物），37 ℃反应 2 h。用酶标仪405 nm波长处读取A值。 ??? 1.6? Western blotting ??? 细胞经不同浓度大黄素处理后，加入适量细胞裂解液裂解细胞，收集于1.5 ml的离心管中，以12 000 r·min-1? 4 ℃ 离心20 min。取上清，用Bradford法测定蛋白含量，每种样品各取蛋白50 μg上样，SDSPAGE电泳，电转移至醋酸纤维膜上，BSA封闭，依次滴加一抗（1∶1 000）及二抗（1∶3 000），室温下孵育后洗膜显像。 ??? 1.7? cathepsin B活性测定 ???