荧光定量PPT.ppt

From theory to application （real-time PCR）;;Real-time PCR 基本原理;PCR 反应的原理;Cycle #;;Ct值的定义;;普通PCR 实时定量PCR(QPCR);常用化学方法-SYBR/Taqman;;相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜 不需要特别设计探针 SYBR Green , 最常用的插入染料 SYBR Green 染料插入双链DNA，检测灵敏度提高200倍。 和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低 。 不能做多重PCR。;熔解曲线分析;What is HRM;High Resolution Melt;TaqMan 探针;5’;产生很强的荧光信号 容易设计和合成 可以做多重检测 能够进行SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 检测 比插入染料贵;Bio-Rad CFX96 ;How it works…;Stationary Samples – Scanning Detector;M I Q E ——定量PCR的国际化标准及语言规则;过去的16年，该技术的应用呈指数发展，目前在各个领域有25,000余篇文献发表到各种刊物； 但是有大量已发表的实验数据都是不一致的，更有甚者，毫无关联或者极具误差性； 当前，real-time PCR被看作准确且灵敏快速进行基因表达分析的金标准； 如果没有严格的技术规范，real-time PCR离金标尚远。 ;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;No.1;*;*;*;*;*;微滴式数字 PCR – 第三代PCR;微滴分析仪;微滴式数字PCR流程;微滴生成;将微滴发生卡放入微滴发生器内 油水混合，微滴生成 20,000个微滴/样品;用移液器将生成的微滴转移到PCR板相应的孔内 用铝膜封闭PCR反应板，进行扩增 扩增后微滴成为“胶囊化”的稳定状态;对PCR扩增程序没有任何限制 可采用温度梯度功能对PCR反应条件进行优化 ; 将PCR反应板直接放入微滴分析仪 自动对样品进行逐个分析 分析仪确保每个微滴逐个通过检测器(FAM/VIC检测) 对每个微滴进行荧光检测 (32孔/小时);阳性微滴意味着至少含有1个DNA或cDNA分子 分析软件根据每个样品中阳性微滴/总微滴的数目计算出靶分子的浓度(copies/uL);拷贝数变异 (CNV). CNVs是基因变异研究新的发展方向。与疾病的关联为人类疾病研究与新药开发提供了新的方向。ddPCR绝对定量的方式是CNV研究的首选 稀有异常序列的检测. 研究人员往往需要在来源复杂的样品中确认是否含有特定的突变细胞。如在大???正常体细胞中检测少量的肿瘤细胞。ddPCR特有的微滴化处理步骤充分阐释了数字PCR的概念 包括miRNA在内的基因表达研究. ddPCR绝对定量的方式当然能完成特定目标基因表达丰度的测定，其高灵敏度、高精确度的特点尤其适用于低丰度miRNAs的检测 二代测序(NGS). 对于利用emulsion PCR进行测序前文库制备的二代测序实验室，提供了一种有效的QC手段，提高测序成功率；对测序结果进行验证 ;1. 环境微生物群落分析（meta genomics） 2. 生物环境监测（BEM） 3. 肿瘤发生相关基因稀有突变分析（早期筛查，诊断，预 后跟踪）与个体化医疗 4. 器官移植后抗排斥监测（如心脏移植后供体DNA检测） 5. 无创产前筛查与诊断 6. 生物制品宿主残留检测 7. 地沟油动物源性核酸片段检测 8. 转基因检测及标准品准确定量 ;*