第二章 固定化酶(1~3节) 酶工程课件.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程 第三章 固定化酶 第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 第一节 概述 一. 固定化酶的发展史 固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。 二. 固定化酶的概念 固定化酶是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。immobilized enzyme 三． 固定化酶的优缺点 优点： 1 不溶于水，易于与产物分离； 2 可反复使用； 3 可连续化生产； 4 稳定性好。 缺点： 1 首次投入成本高 2 固定化过程中往往会引起酶的失活。 3 大分子底物较困难 四．制备固定化酶的依据 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离。 第一节结束 点击返回 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标 一． 影响固定化酶性质的因素 固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是固定的方法及载体而显著不同。可以概括为三种类型。 1．微环境的影响 微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效应，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。 2．构象改变和屏蔽效应 构象改变是指：酶在固定化的过程中，出于酶与载休相互作用使酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下降。这种效应难以定量描写．也难以预测。通常出现在吸附法和共价键结合法。 立体屏蔽效应是，由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的活性。若在酶和载体间加入臂，可以得到改善。 3．分配效应与扩散效应 分配效应是由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。作为一般规律是： (1)如果载体与底物带有相同电荷，则酶的Km值将因固定化而增大；如果带有相反电荷．则相反。 (2)当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性一PH曲线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。 以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。 (3)采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的Km值将因固定化而降低，其他效应物亦然。 扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的— 种效应。它分内扩散效应和外扩散效应两种。 ①外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜层到固定化酶表面所受到的限制。可以充分搅拌或混合而减小或消除。 ⑦内扩散限制，是指上述物质从固定化酶颗粒表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。 。 二．固定化后酶性质的变化 1． 固定化对酶活性的影响：大多数固定化酶活性下降 原因：酶结构的变化 空间位阻 酶结构的变化：酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与载体相结合。这两者造成的酶活力下降可以适当条件加以克服。 空间位阻：载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降。这个影响难以克服。 另外，在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致。