第四章 基因工程所需的基本条件.ppt

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第四章 基因工程所需的基本条件

一、限制性核酸内切酶 2、质粒的基本性质 1)质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型。 ①严紧型质粒(stringent plasmid)拷贝数少,大约有1-几个拷贝。 ②松弛型质粒(relaxed plasmid)拷贝数多,有10—60份拷贝。 2)质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性,不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例: ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构,彼此不相容; pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构,彼此不相容。 3)质粒的转移性 3、标记基因 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,但是对DNA重组分子的筛选具有重要意义 包括: 物质抗性: 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成: 细菌毒素、天然色素、有机碱 组成: 特点: 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 常用质粒克隆载体:pUC系列 pUC18/19特点: 大肠杆菌中蛋白表达形式 (1)完整目的蛋白 (2)融合蛋白:两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起表达形成的蛋白。 当蛋白质表达以后,有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达,并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽(Tag),常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)、六聚组氨酸肽(polyHis-6,6×His tag)、金黄色葡萄球菌蛋白质A或G(protein A, protein G )等。 真核表达载体 酵母表达载体 昆虫表达载体 哺乳动物细胞表达载体 1)氯化铯密度梯度离心法: 原理:是一种沉降平衡离心法,经超速离心,离心介质CsCl形成一连续的密度梯度,在过量EB存在的条件下,各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小(1.3 g/cm3~1.4g/cm3),浮于液面;RNA密度大(2.0g/cm3),沉于管底;各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间,处于中部。过量EB处理前,细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右,难以区分。经过量EB处理后,不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样,因而密度下降不一致,可有效分离。其中,闭环质粒DNA为超螺旋三级结构,EB不易插入,结合量少,密度下降小,约为1.59 g/cm3;而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB,密度下降较多,约为1.54 g/cm3,从而能与闭环质粒DNA分开。 1、 λ 噬菌体的生物学特性 2、λ噬菌体的生活周期 裂解周期和溶原周期 溶原周期 λ噬菌体感染大肠杆菌后,通过同源重组,将其DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上,并不产生子代噬菌体颗粒,这种状态称为溶原状态,这个过程称溶原化。整合主要由λ -DNA上的cⅠ和int两基因的产物所激活。 原噬菌体(prophage): 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体,随细菌的染色体复制而复制。 3、λ噬菌体的基因组 1)线状双链DNA分子,全长48.502bp。 2)两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端(cohensive end,cos),该末端称为cos位点。 3)当λ侵入宿主细胞后,线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子。 4、λ -DNA载体的构建 λ噬菌体的缺陷: λ噬菌体的改造 M13噬菌体载体遗传稳定性下降原因: 带有大片段外源DNA的重组噬菌体,其生长速度总是要比具小片段插入的缓慢得多。因此当外源DNA插入片段发生部分缺失之后,在强大的选择压力作用下,结果经过连续传代之后,在细菌群体中,含有大片段重组噬菌体的细胞比例便被相对地稀释掉了。 五、噬菌粒(phagemid) 六、考斯质粒(cosmid载体、粘粒) 1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector(cos site-carrying plasmid) 七、人工染色体载体(artificial chromosome vector) 定义: 人工染色体载体是利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体,其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美,用来克隆大片段的DNA,不做常规克隆使用。

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