芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定.pdf

摘要(Abstract) 摘要 分子生物学等生物技术的快速发展，为中药的研究开辟了许多新的途径。其 中，应用小分子量中药活性成分的单克隆抗体(monoclonalantibodies，MAbs)建 立的免疫测定系统已成为受体结合分析、酶测定等研究的一个重要工具，也是药 用植物的一种定性定量分析技术，这些都与MAbs的特异亲和力、可大量生产等 相关。但是，单克隆抗体用于现代中医药的研发方面的文献至今尚所见不多，因 此，亟需探索有关单抗技术在中医药研究中的技术基础及其应用。 本研究的目的就是通过制备芍药的主要活性成分—芍药苷(paeoniflorin，PF) 的单克隆抗体，从而建立以此为基础的酶联免疫测定(enzyme．1inked immunosorbent assay，ELISA)方法，对生药和方剂中的芍药苷进行定量分析。 内容主要包括人工抗原的合成与鉴定、动物免疫及细胞融合、抗体筛选与纯化、 MAbs性质测定、利用制成的单抗建立ELISA方法及其验证等。 humanserum， 首先采用高碘酸钠法将PF分别与人血清白蛋白(albumin 通过MAIDI．TOF MS和紫外光谱对偶联物进行鉴定，PF．HSA半抗原数9，人工 抗原合成成功。再用聚乙二醇法(PEG 胞与对次黄嘌呤．氨基蝶呤．胸腺嘧啶核苷(HAT)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系SP2／0 融合形成杂交瘤细胞，细胞的融合得率较高，可达87．19％。通过HAT培养基筛 选、ELISA检测杂交瘤细胞的培养上清液和多次有限稀释克隆化，最终获得两株 能稳定分泌抗PF单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为P1E6和P5H10。 其次，分别用体外无血清培养和腹水诱生两种方法大量生产单克隆抗体。所 MS检测，MAbs纯度 得单抗经蛋白质G亲和柱纯化，SDS．PAGE和MALDI．TOF 很高，ProteinG亲和柱法纯化抗体成功。通过ELISA法对抗体的特性进行测定， tool／L；所得两 种MAbs具有高度特异性，和PF有强烈的交叉反应，同芍药内酯苷的交叉反应率 较低，分别为0．322％、O．524％：与樟脑的交叉反应率为O．018％和0．078％。其 他几种结构类似物几乎不与MAbsP1E6和P5H10发生交叉反应。两株MAbs均可 用于PF的含量测定和筛选分析。 摘要(Abstract) 最后，将抗PF的MAbs应用于ELISA分析，建立了直接定量测定样品(赤 芍)PF含量的免疫测定方法。结果显示样品的竞争性ELISA检测结果与HPLC 的检测结果基本一致，且竞争ELISA比HPLC法的灵敏度高很多。 和HPLC相比，新的ELISA分析法更为快速、灵敏、操作简便且重现性良 好。它的建立使得大量样品的快速测定成为可能，特别适于有效成分含量极少的 样品，可用来定量测定芍药及其复方中药的芍药苷总含量。总之，新建立的竞争 ELISA方法可能成为测定不同样品中PF含量的强有力工具，从而对其进行生产 质量控制和药理标准化研究。 关键词：芍药苷；单克隆抗体；酶联免疫测定 2 摘要(Abstract) Abstract monoclonal Immunoassaysystemsusing antibodies(MAbs)againstnaturally bioactive lowermolecularhavebecomeoneof having weights occurring compounds forthe to