三株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药基因tetL对比毕业论文答辩.ppt

* 三株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药基因tetL的对比 刘仕琦 金文杰 指导老师 答辩人 扬州大学 背景 Part 1 1.1背景知识 四环素耐药基因tetL 01 02 03 细菌对四环素的耐药机制 耐药基因的失效 1.2实验背景 野生分离株来源 药敏反应 tetL检测 1.3实验目的 本实验室在对临床分离的3株金黄色葡萄球菌进行耐药性分析时发现携带相同耐药基因但耐药表型不同，其中1株含有四环素耐药基因tetL的金黄色葡萄球菌对四环素敏感，本实验试图通过分析该菌株携带的tetL基因的碱基序列，找到耐药基因可能失效的原因。 研究方法 Part 2 研究过程 1 引物设计，目的片段扩增。 2 3 4 耐药基因的克隆及鉴定 比较测序结果 药敏试验 2.1引物的设计和目的片段的扩增 主要问题一 主要问题二 95℃ 5min；95℃ 1min、Tm 1min、72℃1min45s，32个循环；72℃ 10min 靶基因 引物序列（5’-3’） Tm(℃) 产物长度（bp） GenBank编号或参考文献 All-tetL GCGGGATCCATGGTTTTGAACGTCTCATT 58 1287bp FN435329.1 GCGCTCGAGTTAGAAATCCCTTTGAGAATG 2.2耐药基因的克隆及鉴定 一、回收耐药基因 二、连接T载体 三、感受态细胞转化 四、提取质粒 五、酶切鉴定 六、阳性测序 2.3序列测定结果的比较 将测序所得结果分别与GenBank 中已发表的多个耐药基因的tetL基因序列进行比较，并使用DNAStar 5.0 对其在核酸与氨基酸水平上的同源性进行分析。 2.4 目的片段和原核表达载体的构建 1.提取表现氨苄抗性的DH5α（含有pGEM-T-tetL的DH5α）的质粒； 2.酶切提取的质粒和pGEX-6p-1 ，回收目的片段和克隆载体； 3.取目的片段和克隆载体连接； 4.耐药基因连接产物转化感受态BL21，涂布含有Amp+ LB固体平板培养 ； 5.挑取单菌落，接种于Amp+ LB液体培养基 ； 6.提取质粒； 7.酶切质粒，凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察，将阳性送检。 2.5药敏试验 按照2010版CLSI描述的K-B法操作标准检测构建好的 tetL克隆株（BL21）对药物的敏感性。 结果 Part 3 3.1耐药基因all-tetL扩增和转化后酶切鉴定结果 and all-tetL耐药基因电泳扩增图 1. 阴性对照 2. MP00368 3. MP00213 4. MP00350 pGEX-6p-1-tetK和pGEX-6p-1-tetL双酶切鉴定结果 M.1Kb DNA Marker； 1-9. pGEX-6p-1-tetK转化白斑菌中质粒双酶切(BamHI和XhoI)产物； 10-18 pGEX-6p-1-tetL转化白斑菌中质粒双酶切(BamHI和XhoI)产物； 3.2耐药基因all-tetL测序结果 MP00368株的tetL基因上的第356位基因突变导致119位氨基酸突变 3.3三株菌株中tetL分子的演化研究 讨论 Part 4 5.1 主要问题分析 1.本研究中all-tetL基因突变与耐药性关系的可能原因分析； 2. 控制抗生素耐药性的措施。 致 谢 感谢母校提供的学习与实践的机会； 感谢金文杰老师的耐心指导； 感谢林伟东师兄的帮助； 感谢答辩评审！ 感谢您的批评指正 刘仕琦 金文杰 指导老师 答辩人 * * * * *