05 目的基因的获得.ppt

二、 cDNA文库构建 基因组DNA文库的优点 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列； cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 二、 cDNA文库构建 cDNA文库的优点 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能 二、 cDNA文库构建 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。 三、目的基因的获得 　　　　基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 　　　 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 三、目的基因的获得 目的基因用途很广，主要有以下几个方面： 研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。 与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。 研究生物种系进化与相关同源性。 应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。 三、目的基因的获得 　基因工程的目的 　　　采用DNA重组技术从不同生物基因组中优良性状相关的基因克隆，转移同一生物基因组中，培育出具有高度应用价值的新物种。 　目的基因 　　　那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，主要指结构基因。 　目的基因包括 　　　蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物讲解相关的基因等。 三、目的基因的获得 　(一)结构基因组成 　1.原核生物的基因组成 　　（1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有 ATG的起始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。 　　（2）启动区：RNApol识别、结合和开始转录的一段DNA核苷酸序列。 5′ TTGACA TATAAT A/G 3′ 3′ AACTGT ATATTA T/C 5′ -35序列 -10序列 识别序列 Pribnow框 转录起点 16～19bp 5～9bp 三、目的基因的获得 (一)结构基因组成 　1.原核生物的基因组成 三、目的基因的获得 (一)结构基因组成 　1.原核生物的基因组成 三、目的基因的获得 (一)结构基因组成 　1.原核生物的基因组成 　　（3）SD区：在起始密码子ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤的保守序列，其与16S rRNA3′端序列互补。 　　　SD序列与起始密码子ATG之间的距离决定了mRNA在细菌中的转录效率。 SD序列：5′AGGAGGU3′ 3′UCCUCCA 5 ′ 16S rRNA 三、目的基因的