3.蛋白质VII.ppt

亲和层析 反相层析中的离子配对试剂的作用 反相层析中的离子配对试剂的作用 高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）与普通的色谱技术不同的是：填料密度高，洗脱液压力加大，分离效果更好。是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。 高效液相色谱技术 （HPLC） 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 HPLC层析系统 泵的结构 (三）电 泳 技 术 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳按其分离的原理不同可分为： ⑴ 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带，这是当前应用最为广泛的电泳技术。 ⑵ 自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。 2.电泳的分类 ⑶ 等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。 ⑷ 等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。 （5）脉冲电泳：通过改变电场方向和强度，从而提高大分子的分离效果。 （6）毛细管电泳：将介质填充在毛细管中，因散热效果较好，可用高电压进行电泳。 按支持介质的不同可分为： ⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis） ⑵ 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） ⑶ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 按支持介质形状不同可它为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳。 按用途不同可分为： ⑴ 分析电泳； ⑵ 制备电泳； ⑶ 定量免疫电泳； ⑷ 连续制备电泳。 按所用电压不同可分为： ⑴ 低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。 ⑵ 高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。 3.常见的电泳设备 1708年Reuss的实验 1930年Tiselius的装置 最早的电泳装置 最早的电泳装置 4.几种常见的蛋白电泳方法 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳. 2.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.等点聚焦电泳 4.双向电泳 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 Native-PAG VS SDS.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 主要的分离介质是聚丙烯酰胺凝胶。电泳分两段进行，开始是浓缩胶，其作用是使得蛋白质被压缩成很薄的薄层，使被分离的分子间尽可能地缩短距离。然后进入分离胶进行分离。 三种效应: 样品浓缩效应分子筛效应电荷效应 第五章 蛋白质的理化性质与分离和纯化 蛋白质的理化性质与分离方法 蛋白质溶液胶体性质 沉淀 特定的空间构象，分子量一定 分子筛层析； 在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等； 一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域 有机溶剂沉淀，疏水层析； 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的酸碱性质 1.蛋白中的解离基团 2.等电点 3.等离子点 蛋白质与多肽一样，