贵州省精神分裂症患者弓形虫感染状况调查及其基因型鉴定word论文.docxVIP

型虫株type12最多，占分离株总数的46.7%，其次是Ⅱ和 Ⅲ，经典型出现的频率不高[23]。而在美洲的中部和南部地区弓形虫具有较高的遗传多样性，共鉴定出42 个弓形虫基因型，主要是Ⅱ、Ⅲ型和ToxoDB#7型虫株[24]。中国是一个大国，有丰富的生物多样性，2007年Dubey[25]首次从中国广东猫身上分离到17株弓形虫，并鉴定出两型，其中主要是ToxoDB#9（也叫Chinese1），占88.23%，该型不同于经典的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，属于不典型虫株；有文献报道2009年[26]从甘肃、浙江、广东省采集猪和猫的样本中，鉴定出4种弓形虫基因型，Chinese1占70.59%；随后 2010[27]年和2011年[28]调查云南、河南、河北的猪样本， 2012年[29]从北京采集的猫样本，还有2013年Wang L等[30]从中国多个地区分离到23株弓形虫虫株，也主要鉴定到该基因型，说明Chinese1是中国动物弓形虫感染的主要虫株。100100不同弓形虫基因型其毒力也有所差异，并且与不同的疾病相关。虽然三种经典虫株之间基因差异性小于1%，但是毒力却有显著地不同，以I型虫株作为统一的小鼠致死性标准(LD=1); Ⅱ和Ⅲ型虫株毒性较弱(LD≥103)。I 型与先天性感染有关，可以引起流产、死胎等，Ⅱ型虫株则引起人慢性感染，并导致免疫功能不全的病人产生急性的弓形虫病，Ⅲ型则主要出现在动物感染当中。三种虫株都能诱导人产生特异性的抗体[22, 31]。因此从基因水平上了解弓形虫的分类、分布以及毒力等特征將为精神分裂症弓形虫感染的防治奠定重要基础。本研究通过免疫学和分子生物学方法调查贵州省精神分裂症患者弓形虫感染状况，探讨精神分裂症发生与弓形虫感染的关系，并用Mn-PCR-RFLP方法进行弓形虫基因分型，分析精神分裂症患者弓形虫感染的分子流行病学特点。31材料1.1研究对象材料与方法从贵州省第二人民医院采集112份精神分裂症患者，男性38例，女性74例，年龄范围15-69岁，平均年龄34.8±12.4岁，所有精神分裂症患者均符合WHO《国际疾病分类手册》第10 版(ICD-10)精神分裂症的诊断标准，并排除其他神精系统性疾病。从贵阳医学院附属白云医院采集101 份健康体检人群，男性46 例，女性55例，年龄范围13-65 岁，平均年龄32.3±7.5 岁，排除体检指标异常及有明显身体疾病和精神异常。精神分裂症患者与健康体检人群均为贵州省当地人群，性别与年龄无统计学差异，所有研究对象均知情同意。1.2弓形虫参照检测弓形虫特异性核酸的阳性对照为贵阳医学院免疫学教研室保存的RH 株（国际标准强毒株）。基因分型的标准参照株为下列9株弓形虫：GT1,PTG, CTG, MAS,TgCgCa1,TgWtdSc40,TgTouCan,TgCatBr5,TgCatBr64，由美国田纳西大学微生物系苏春雷教授馈赠。1.3主要试剂ELISA试剂盒弓形虫特异性IgG、IgM抗体、弓形虫循环抗原（CAg）ELISA检测试剂盒，均购自珠海海泰生物制药有限公司。PCR试剂全血基因组DNA 提取试剂盒、多重PCR扩增试剂盒、DNAMarkerⅠ购自北京天根生物技术有限公司。DNALoadingBuffer(6×)购自大连宝生物工程有限公司。限制性内切酶购自NEB（NEWENGLANDBioLabs）。1.3.3PCR引物合成：由Takara宝生物工程（大连）有限公司合成。弓形虫529bp 片段PCR 用于弓形虫诊断，其引物序列为[32]：上游引物: CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG下游引物: CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATTSAG2(5`-SAG2,3`-SAG2,alt.SAG2),BTUB,GRA6,SAG3,SAG1,c22-8,4c29-2,L358,PK1,Apico10 个位点用于基因分型。每个位点的引物详见表1[33, 34]。表1 Mn-PCR-RFLP各位点的引物序列Table 1. Summaryof primers for Mn-PCR-RFLPmarkers位点外部引物（多重PCR）内部引物（巢式PCR）巢式 PCR产物（bp)5’-SAG23’-SAG2 SAG3 BTUB GRA6F: GCTACCTCGAACAGGAACAC R: GCATCAACAGTCTTCGTTGCF: TCTGTTCTCCGAAGTGACTCC R:TCAAAGCGTGCATTATCGC F: CAACTCTCACCATTCCACCC R: GCGCGTTGTTAGACAAGACA F: TCCAAAATGAGAGAAATCGT R: AAATTGAAATGACGGAAGAA F: ATTTGTGTTTCCGAGCAGGT