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;基因工程工具酶; 基因克隆的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶和DNA片段化 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶及其它酶 ;基因工程工具酶;第一节限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）;一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现 1．限制性核酸内切酶： ---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰(Modification)系统（R-M系统）。 ; 在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌； 而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。 1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。 ;l;酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。 ;三．核酸内切限制酶的命名原则 由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的第1个字母（大写）和种名的头2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。 ;限制性核酸内切酶的命名; （2） 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。 （3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的R-M体系时，则以罗马数字表示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。 ;（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核酸内切酶 R．HindIII； 修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。 但在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化： ①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 ②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。 ;四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 ;A.识别序列;EcoR Ⅰ：;B. 切割类型： 检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种排列方式之一： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（ 3’- 和 5’- ）； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA片段。 ;三种酶切末端; ; 产生的末端特征： 我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。 平末端的DNA片段与粘性末端相比，则不易于重新连结，耗能多。 ;(2) 同裂酶 (isoschizomers) 来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端，这类酶称为同裂酶(isoschizomers)。 若同裂酶的切点相同，会形成同样的末端。例如，HpaⅡ和MspI（C/CGG）；; 来源不同，