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剑叶金鸡菊内生细菌的分离及鉴定 　　摘要：为研究入侵种剑叶金鸡菊的内生细菌与宿主对环境适应机理的相关性，发现独特的细菌资源，采用牛肉膏蛋白胨培养基分离剑叶金鸡菊内生细菌，利用生理生化及１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析等鉴定方法对内生细菌进行鉴定。结果表明，共分离得到２２株细菌，其中Ｈ１鉴定为Ｇｏｒｄｏｎｉａ ａｌｋａｎｉｖｏｒａｎｓ，Ｈ４鉴定为Ｄｉｅｔｚｉａ ｋｕｎｊａｍｅｎｓｉｓ，Ｈ５为 Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ，Ｈ７鉴定为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ。 　　关键词：剑叶金鸡菊；内生细菌；鉴定；系统发育 　　中图分类号：Ｑ９３９．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－0958-03 　　 　　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ Ｌ． 　　 　　ＨＥ Ｌｉｎ-ｑｉａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇ，ＳＵＮ Ｌｉ-ｄａ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌｏｒａ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｐｅｃｙ Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ Ｌ．， ｔｈｅ adaptation ｍｅｃｈａｎｉｓｍ to ｉｔｓ ｈｏｓｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， and ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ， 22 ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ Ｌ． Ｔｈｅ １６Ｓ ｒRＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｄ． Ｓｔａｒｉｎｓ Ｈ１， Ｈ４， Ｈ５ ａｎｄ Ｈ７ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｇｏｒｄｏｎｉａ ａｌｋａｎｉｖｏｒａｎｓ， Ｄｉｅｔｚｉａ ｋｕｎｊａｍｅｎｓｉｓ， Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ Ｌ．， ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ 　　 　　植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居，对植物不造成实质性危害而与植物建立了和谐共生关系的微生物［１］。宿主与内生细菌之间形成共生或互生的关系，这种关系还受到环境因子的影响。环境条件和宿主基因型决定内生细菌的遗传多样性［２］。植物内生细菌的调控会直接或间接影响植物的生长、生存［３］。 　　剑叶金鸡菊为菊科金鸡菊属植物，别名大金鸡菊线叶，原产于北美，为青岛园林部门引进［４］。金鸡菊类耐寒耐旱，对土壤要求不严，适应性强，对二氧化硫有较强的抗性。具有极强的生长能力和繁殖能力，与林木争地，降低土壤肥力，凡是该植物生长地段其他植物都不能生长，以侵占土地危害为特点，在山东进行的林业有害生物调查中，被列为入侵种［５］。 　　本实验对剑叶金鸡菊内生细菌进行分离，并用１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析及建立系统发育树等方法对其中的７株细菌进行了鉴定，有助于揭示剑叶金鸡菊对环境适应的机理，为筛选其中具有特殊性能的细菌和对剑叶金鸡菊的生物防治奠定了基础。 　　１材料与方法 　　１．１实验材料 　　剑叶金鸡菊，采自山东威海沿海。 　　培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。配方为：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨 １０ ｇ，氯化钠 ５ ｇ，琼脂 １５～２０ ｇ，蒸馏水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ值７．４～７．６， 灭菌条件为：１．０５ ｋｇ／ｃｍ２，１２１．３℃，２２ ｍｉｎ。 　　１．２实验方法 　　１．２．１剑叶金鸡菊的表面灭菌将采集来的剑叶金鸡菊的花、叶或根用自来水冲洗干净，滤纸吸去水分，用７５％的酒精浸泡２ ｍｉｎ，无菌水淋洗，再用３．５％的双氧水浸泡３ ｍｉｎ，无菌水充分淋洗［６］。 　　１．２．２剑叶金鸡菊内生细菌的研磨分离将金鸡菊放入灭菌的研钵中充分研磨，收集匀浆。利用梯度稀释平板分离法对内生菌进行分离，２８℃下培养２４～４８ ｈ［６］，并以无菌水淋洗液涂平板作为对照组，若对照平板上无菌落长出，则基本可判定研磨液中的细菌是内生菌。纯化后利用保种液保藏。 　　１．２．３内生细菌菌落生长特性的观察及生理生化特性的鉴定将分离的菌株分别在２８℃和３８℃下培养。对菌株进行革兰氏染色、芽孢染色及显微观察。参照其显微形态、菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色等对内生菌株进行鉴定。 　　１．２．４１６S ｒＲＮＡ鉴定 　　１）ＤＮＡ的提取