芸薹属ANR(BAN)基因家族RNA干扰载体的构建.docVIP

芸薹属ANR(BAN)基因家族RNA干扰载体的构建 　　摘要：花青素还原酶(ANR)是原花青素生物合成的关键酶，对种皮色素的积累起重要作用。黄子是油莱的重要优质性状，但甘蓝型油菜中其基因型缺乏，表型不稳定，分子机理不清。该实验克隆了芸薹属ANR基因家族的RNA干扰片段BANRI，将其反反片段、正义片段采用NcoI+AatII、BamHI+Xbal分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成重组载体pFGC5941M―BANRI(简称为pBANRI)，复合PCR鉴定表明载体构建成功，并转化根癌农杆菌菌株LBA4404，获得工程菌株。pBANRI的构建有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理。探索对油莱等植物种皮色素进行分子育种的可能性。 　　关键词：芸薹属；甘蓝型油菜；原花青素；ANR(BAN)；RNAi；载体 　　中图分类号：0782　文献标识码：A　文章编号：0439-8114(2010)04-0769-04 　　 　　芸薹属(Brassica)植物甘蓝型油菜(B.napus L.)是世界上重要的油料作物之一，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)亲缘关系较近。在相同遗传背景下，黄子油菜比黑子油菜具有种皮薄，出油量高，油和饼粕中色素、木质素含量低等优点，因此黄子性状是油菜遗传改良的一个重要目标。甘蓝型油菜中不存在天然的黄子基因型，但通过远缘杂交培育的黄子甘蓝型油菜存在黄子表型欠稳定、一致性差的问题。 　　对拟南芥等植物的研究表明，主要种皮色素是原花青素(Proanthocvanidin.PA)，也叫缩合单宁。PA经公共苯丙烷一核心类黄酮一原花青素复合途径而合成，先后涉及12个关键酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3，H、DFR、LDOXJANS、LAR、ANR、LAC)的催化反应和3种转运蛋白(GST、MATE、ATPase)的胞内转运，并有6种转录因子(WIP ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)参与调控PA的合成与积累。花青素还原酶(Anthocyanidin reductase.ANR)位于花青素合成酶(ANS)的下游，将花青素转化成表儿茶素(2，3一顺式黄烷3-醇)。它是一类PA单体，随即向液泡转运并聚合成为缩合单宁，在拟南芥中ANR基因又被称为BANYULS(BAN)基因，因为该基因突变后种皮积累花青素而显红色。拟南芥中缺乏LAR.ANR／BAN是PA特异途径的第一个关键酶，而在其他多数植物中PA特异途径的第一个关键酶是LAR。它在LDOX之前可直接将DFR的产物无色花青素转变成2.3一反式黄烷3-醇，然后形成缩合单宁。 　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后水平的基因沉默技术，相对于反义及共抑制技术，RNAi可获得更高的基因沉默效率：构建可转录为dsRNA的植物表达载体转化植物，可实现植物中目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。 　　此前本课题组采用RACE技术已经克隆了甘蓝型油菜ANR基因家族(BnANRI至BnANR4)、白菜ANR基因家族(BMNRI、BrANR2)和甘蓝ANR基因家族(BoANRI、BoANR2)的全长cDNA和基因组序列。在此基础上，本研究构建了芸薹属ANR基因家族的RNAi载体，将有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理，探索对油菜等植物种皮色素进行分子育种修饰的可能性。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　1)植物材料：甘蓝型油菜的一个黑子保持系5B的基因组总DNA和其生殖器官(蕾，花，开花后10、20、30 d的种子)混合总cDNA，由本实验室制备。 　　2)菌株和质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5ct、根癌农杆菌菌株LBA4404由本实验室保存，RNA干扰载体pFGC5941(AY310901.1)的DH5ct菌株购自俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心。pFGC5941M是由本课题组在pFGC5941的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2／2)替换了pFGC5941上过长的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加了一个Aat切点，使载体构建和鉴定更方便，更有把握高效地介导目标基因的沉默。 　　3)试剂：pMDl9-T载体、DNA Ligation Kit Ver.2.0、λ-HindDNA marker为大连宝生物(TaKaRa)产品。Easy-Taq DNA聚合酶及Buffer、dNTPs、DL2000 plus DNA marker、琼脂糖等为北京全式金(Transgen)产品。Biospin胶