微生物鉴定常用的生理生化试验实验报告.docxVIP

山东大学实验报告 2017年 12月 4 日 ___________________________ 科 目：微生物学实验 题目：微生物鉴定常用的生理生化试验 姓名：丁志康目的要求1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。基本原理1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。（1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。（2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。（3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色的化合物。本试验目的在于测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。（4）柠檬酸试验：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用柠檬酸盐作为唯一碳源时，若细菌能利用这些盐作为氮源和碳源而生长，则能利用柠檬酸钠产生碳酸盐，从而与利用铵盐产生的氨反应，形成NH4OH，使培养基呈碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝。 器材1.菌种:枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌，金黄色葡萄球菌。2.培养基:固体淀粉培养基，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基。3.溶液或试剂:革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红试剂，V.P.试剂，吲哚试剂。4.仪器或其他用具:无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架，酒精灯，小玻璃管。 操作步骤淀粉水解试验(1)将固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。(2)用记号笔在平板底部划成四部分。(3)将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单细胞菌分别在不同的部分点点接种，在平板的反面分别在四部分写上菌名。(4)将平板倒置在37℃温箱中培养24h。(5)观察各种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉酶能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。糖发酵试验1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。2.取葡萄糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌，普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。 在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。3.将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培养24~48h。4.观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。IMViC试验接种与培养用接