湖南大学生物信息学实验报告-W13.docxVIP

实验七 PCR引物设计及评价基本信息：姓名：程瑶学号：201378020205班级：医学1301实验日期：2016-05-24 实验目的和要求：掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索；掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。实验仪器、设备与材料：计算机（联网）实验原理：引物设计原则：A：引物应在序列的保守区域设计并具有特异性；B：引物的长度一般为15-30 bp；C：引物不应形成二级结构；D：引物序列的GC含量一般为40-60%；E：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右最佳；F：引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基；G：引物3’端不可修饰；H：引物3端G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间G值相对较高。引物设计软件Primer premier5.0及Oligo6.0：Primer premier5.0：“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列，软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择。Oligo6.0：Oligo 6.0的界面是三个图，Tm图、ΔG图和Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。所以引物设计的最佳搭配是“Premier”进行引物搜索“Oligo” 对引物分析评价。实验内容：使用Primer premier5.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计；使用oligo6.0对引物进行评价分析；使用blast工具帮助设计引物和评估引物特异性；实验步骤：略~~~作业：提交使用Primer premier 5.0 及Oligo 7.37软件进行人肉素(leptin)mRNA引物的设计结果：使用引物设计软件Primer premier5.0进行人瘦素 (leptin) mRNA引物搜索结果截图。（包括Sense链和Anti-sense链截图）：A：先把leptin的序列输入到Primer中：然后进入primer：然后点击search，可修改部分数据去得到你想要设计的引物：得到search的结果，分三种：sense、anti-sense、pair：↑ Sense↑ Anti-sense↑ Pair 因为pair是综合sense和anti-sense的结果，所以我在pair中选择引物：根据引物设计的原则，如sense链和anti-sense链的Tm值相差不能过大，GC含量要在40%-60%之间，hairpin、dimer和false priming要尽量少的found等，我选择第二条引物，即2672-2968：其sense链为：其anti-sense链为：oligo6.0分析此对引物的结果。（包括Duplex formation、Hairpin formation、False Priming Sites截图）：A：首先呢~要把leptin的序列输入到Oligo中去，并把之前从Primer premier 5.0中所得到的引物在Oligo中表示出来：即这段：然后进行分析，我在analyse中进行了4种分析，分别是Duplex formation、Hairpin formation、Composition Tm、False Priming Sites：A：Duplex formationB：Hairpin formationC：Composition TmD：False Priming Sites从上面4种分析可见：①在5’和3’的引物中，有4个碱基位点可以互补，可以配对形成双链。但无形成环状的配对位点；②无发夹结构；③Oligo所分析出的Tm值与primer引物设计出的Tm值有差异；④正义链有三个假启动位点，反义链有5个假启动位点。总结可知，该引物无发夹结构，但是会有双链形成的和数个假启动位点的可能，所以并不是多么完美的引物。但相比较其他几条引物来说，这条是最好的~综合Primer premier5.0与oligo6的引物设计结果为：A：sense ：5’- GTAGAGTTTGAAGGAGGTGA -3’(20bp) antisense：5’- CAGCCTGATTAGGTGGTT -3’(18bp) 思考题： 怎么设计引物把上面提到的leptin的全长拉出来？A：老师，说实话，我还是没完全理解你说的拉出全长，我就按我的理解来了……首先，进入primer：可见一开始时引物为1-25，sense链和anti-sense链都是25个碱基；因为sense链已经是从1开始了