[农学]第四章色层分析法2.ppt

4.5 薄层层析法及其实验技术 提 纲 4.5.1 技术参数 4.5.2 理论基础 4.5.3 薄层层析固定相选择原则 4.5.4 薄层层析展开剂选择原则 4.5.5 薄层层析的实验技术 4.5.6 应用技术 薄层层析法特点 4.5.1 技术参数 在薄层层析分离中，原点距展开剂前缘的距离为12cm，原点距展开斑点A.B的距离各为6cm.8cm。A.B两斑点的比移值各为多少？ 4.5.2 理论基础 4.5.3 薄层层析固定相选择原则 何种层析(吸附、分配、亲和、凝胶） 被分离组分性质（极性、离子、分子 大小等） 吸附剂吸附性能强弱 常用固定相 4.5.4 薄层层析展开剂选择原则 4.5.5 薄层层析的实验技术 制备薄层板： 干板---软板，湿板---硬板 定性定量时薄层厚度为0.2-0.3mm 制备薄层的厚度要求约为0.5-2mm 活化 形式：硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、 硅胶HF360 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物） 特殊薄层 混合薄层：两种不同吸附剂 酸碱薄层：稀酸或稀碱代替水 络合薄层：加入络合剂 涂布固定液的薄层： 具有浓缩区的薄层：不同粒度 高效薄层：极细均匀的吸附剂 展开： 极性增强顺序：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸 原则：先用单一溶剂，再用混合溶剂 在硅胶薄层上分离生物碱： 单一溶剂：环己烷、苯、氯仿 混合溶剂：苯-氯仿（9：1，1：1） 环己烷-氯仿-二乙胺（5：4：1） 苯-乙酸乙酯-二乙胺（7：2：1） 苯-正庚烷-氯仿-二乙胺（60：50：10：0.2） 二乙胺：改变极性，调整酸碱度，增大试样的溶解度 聚酰胺薄层 展开剂洗脱能力的大小顺序： 水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液甲酰胺二甲基甲酰胺 在聚酰胺薄层上用混合展开剂： 水-乙醇（1:1） 水-甲醇（1:1） 水-乙醇-乙酰基丙酮（4:2:1） 水-乙醇-丁酮-乙酰基丙酮（13:3:3:1） 水-乙醇-乙酸-二甲基丙酰胺(6:4:2:1) 二甲基甲酰胺-苯 （3:97） 数值分析方法 用56种展开剂分离22种磺胺类药物时，可较快地找到最佳 系统组合 展开方式 定性：比移值，斑点的显色特性，斑点的原位光谱扫描，与其他分析技术的联用 定量：目视比较半定量法，洗脱法（误差约为1-5% ），薄层扫描仪 瑞士CAMAG9(长玛)公司,质量优异, 价格昂贵,主流薄层色谱扫描仪为SCANNER-Ⅲ。 日本SHIMADEU(岛津) 公司销售量大,其主流扫描仪为CS-9300、CS-9301。 上海科贺生化技术有限公司是国内唯一的薄层色谱扫描仪生产厂商 4.5.6 应用技术 在医药方面的应用 产品质量控制及杂质检验 四环素中差向四环素的含量应低于一定标准，因为后者毒性较大。溶四环素试样于甲醇中配成一定浓度的溶液，取一份点于硅藻土薄层上，用丙酮-氯仿-乙酸乙酯（3：1：1）的混合溶剂为展开剂展开后，用浓氨水熏，然后在254nm的紫外光下观察，除四环素主斑点外不得出现差向四环素的杂质斑。 反应终点的控制 柱层析 纸层析 分配层析：6~7%键合水 滤纸要求： 物理性状均匀—展开速率均匀； 一定的机械强度—防变形； 一定的纯度，定性灰分0.1%，定量灰分0.05%; 厚薄、纤维松紧、纵横向； 前处理 展开剂 Rf：0.05~0.85，ΔRf0.05； 不与被分离组分反应； 层析点圆整； 不选高沸点有机溶剂，影响展开后干燥。 显色：在紫外光下观察，以蒸汽熏， 喷以各种显色剂以及生物自显影 TLSee薄层色谱扫描仪 全自动展开仪 ADC2(瑞士) 全自动控制薄层活化、预平衡，展开缸饱和，展开距离及干燥等所有展开步骤，实时监控并报告展开温度及湿度  一束光线的波长λS是被测物的吸收峰所在；另一束光线的波长λR是被测物不吸收的，可使由于薄层不均匀所引起的基线波动得以消除 由于斑点中被测组分的分布是不均匀的，一般是斑点中心被测组分较多，周围较少，因此采用微小光束，曲折形的扫描方式 采用背景补偿来消除铺薄层所用的吸附剂中可能含有杂质和显色不均匀性的影响