NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的差异分析比较.docVIP

NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位 点的差异分析比较 袁小远杨金兴张玉霞孟凯奎葱王友令艾武 山东省农业科学院家禽研究所 摘要： 本文就禽副黏病毒的两种不同血淸型APMV-1 （以NDV为代表）和APMV-4的F和 HN蛋白糖基化位点进行分析比较。分析显示:F蛋白糖基化位点NDV强弱毒株毒 株均有6处糖基化位点，而APMV-4毒株则只有4处潸在的糖基化位点，而且位 置与APMV-1略有不同。同时，NDV强毒株GM的HN蛋白有5个潜在的糖基化位 点，而La Sota弱毒株有6个潜在的糖基化位点，即538540位为NKT; APMV-4毒 株有7处潜在的糖基化位点，且位置与APMV-1完全不一致。 关键词： 新城疫病毒;禽副黏病毐;F/HN蛋白；糖基化位点; 作者简介：袁小远（1980.01-）,女，汉，山东荣成人，博士，研究方向：禽病 分子生物学与免疫学。E-mail: xyyuanl980@163. com。 作者简介：王友令（1974-）,男，副研允员，研允方向：家禽疫病防控研宄。 E-mail:wangyouling71@163. com。 作者简介：艾武（1964-）,女，研究员，研究方向：家禽疫病诊断与防治。 E-mail:767068849@qq. com. cno 收稿日期：2017-11-17 基金：山东省农业科学院青年棊金项A （2014QNM15）:山东省农业科学院科技创 新工程项目（CXGC2016A10） Received： 2017-11-17 禽副黏病毒病（Avain Paramyxoviridae virus, APMV）是当今危害全球养禽业 的重要疫病之一，其病原共有九个血清型（APMV广9） U1。禽副粘病毒1型最 常见的是新城疫病毒（NDV），ND是引起家禽等的一种急性、烈性传染性疾病， 发病率和死亡率均很高，并且多种禽类等都可以感染。NDV是禽副黏病毒1型的 代表，也是各型禽副黏病毒型中研宄最为透彻的，而对禽副黏病毒APMV 2~9的 分子特性和致病性知之甚少［2-4］。Gen Bank数据库关于APMV-4型的分离毒株信息只有数株，和关研宄非常有限。对于APMV-4的研宄现在已获悉:APMV-4可 以从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、支气管炎等呼吸道症状，而且可以在鸡 胚和部分细胞上培殖［5, 6］。 糖基化作为一种主要的翻译后修饰作用对蛋內质的功能有着重要影响;糖基化位 点能够参与影响病毒蛋G的合成，进而影响其活性和功能。因此，通过分析比较 APMV-1和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的不同，为两者作用机理的研宄提 供科学的理论基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1毒株及背景资料 NDV的GM强毒株、疫苗株La Sota和APMV-4 QY毒株均由山东省SPF鸡研宄中 心分离鉴定保存。GM强毒株为鸡源基因VII型强毒株，La Sota为基因II型弱 毒疫苗株，APMV-4的QY毒株为鸭源弱毒株。 1. 1.2试剂 PCR试剂盒、胶回收试剂盒、载体等均购自宝生物工程(大连)有限公司，Simple RNA kit购自博日生物有限公司。 1.2方法 1.2.1引物设计 参照Gen Bank中NDV和APMV4的全基因组序列(No:KU342001和KC439346)设 计4对引物，分别用于扩增F和HN全长基因。引物由华大基因公司合成，PAGE plus级别纯化。 引物 碱基序列 名称 (5,-3,) APMV1-F1 ATGGGCTC C A A AC CTTCT AC APMV1-F2 TCACGCTCTTGTGGTGGCTC APMV1 -HN1 TCCGTTCTACCACATCACCA APMV1-HN2 CGTCTTCCCAACCATCCTA APMV4-F1 GCCGGTTGGGAATGCATCGAArI APMV4-F2 A AGC GGGG ATT AC G ATTTTT A APMV4-HN1 CGCCCCACAATGTCCAATCAG APMV4-HN2 CTTGGITATCCCCCTGCAGAGT 1. 2. 2 RNA的提取和反转录 GM、La Sota、QY毒株的病毒RNA的提取按照Simple RNA试剂盒使用操作说明 进行，最后用20yl DEPC水溶解RNA,立即进行RT操作。反转录RT按照文献 U1的操作进行，c DNA产物-20°C保存。 1.2.3 PCR扩增、连接和验证 APMV-1 和 APMV-4 的 c DNA 产物 5 u 1、2 X pfu PCR Buffer (含 Mg、d NTP plus) 25 u 1、pfu DNA Polymerase (5U/ Ml) 1 M 1、不同的 F 和 R pr