简便快速的PCR技术管理.ppt

简便快速的PCR技术 * 依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA) 反应体系： 缓冲溶液 AMV逆转录酶 T7 RNA聚合酶 RNase H 引物(下游引物5端带有T7RNA聚合酶启动子序列)。 * 依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA) 原理： 靶RNA经AMV逆转录，形成RNA:DNA杂交体 RNase H降解杂交体的RNA，剩下单链DNA AMV以其为模板,合成含T7RNA聚合酶启动子的双链DNA T7RNA聚合酶以其不断转录出靶RNA 进入新一轮扩增循环 产物主要为反义单链RNA、RNA:DNA杂交体和双链DNA。 * * 依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA) 特点： 可直接扩增特异性单链RNA 整个反应不需PCR仪，无需温度循环，没有高温变性步骤，不会受到外来双链DNA的污染。 反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感性高。 加入变性步骤， 也能扩增双链DNA。 * 环介导等温扩增技术(loop一mediated isothermal amplification，LAMP) 反应体系: 缓冲液 具有链置换特性的DNA聚合酶 dNTP 模板DNA 能够识别靶DNA 6个特异序列的4条引物。引物为2条内引物和2条外引物 * 环介导等温扩增技术(loop一mediated isothermal amplification，LAMP) * 哑铃状模板合成阶段 引物FIP首先和F2c结合启动互补链的合成，形成双链结构(图1b)。 F3再和F3c结合，启动链置换反应，释放出1条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构(图1d)。 这条单链DNA，又可作为模板，在另一端分别结合BIP和B3，合成1条双链，并置换出1条哑铃状的DNA(图1f)。 哑铃结构很快与其一端F1c和F1互补，而由自我引物延伸机制合成1种双链的茎环结构DNA(图1g)。这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料。 * * * 循环反应阶段 FIP和双链茎环结构DNA(图Ig)中的环状结构结合，形成1种有缺口的过渡性茎环结构DNA，该结构在茎上含有靶序列的1个额外反向复制序列，在对面的末端，通过BIP形成1个环状结构。 在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。 * * * 环介导等温扩增技术(loop一mediated isothermal amplification，LAMP) 扩增结果判定：有3 种判定方法 1、琼脂糖电泳后，用EB或SYBR Green I 染色检测。 2、产物中加入M g + 试剂，肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀：阳性-液体浑浊， 静置有白色沉淀。 3、产物中加SYBR Green Ⅰ， 肉眼观察颜色反应： 绿色阳性， 橙红色阴性。 * * * 优点 灵敏度高 能检测到比PCR低10倍的拷贝数。用3一5个细胞样本就可进行动物胚胎性别鉴定。 特异性强 LAMP引物需与靶序列上的6个特异部位准确结合，因此能获得比PCR更高的特异性。 速度快 LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，在30-60min内即可完成反应过程。另外，增加环引物还可缩短时间，大大提高了检测的效率。 设备简单 LAMP反应只需一个简单的恒温器。 产物检测便捷 LAMP反应时产生大量的焦磷酸根离子，能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应休系中是否形成白色沉淀来定性判断。 *